miR-134以PDCD7为靶标减少E-钙黏蛋白的表达从而加速口腔癌的进程

miR-134在恶性肿瘤转化中的功能作用是复杂且有争议的。7月4日，中国台湾国立阳明大学的学者在 International Journal of Cancer（IF= 7.360）杂志发表了题为“miR-134 targets PDCD7 to reduce E-cadherin expression and enhance oral cancer progression”的论文，该论文阐明了miR-134在口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的致癌作用。使用野生型和突变体构建体的报告分析证实，程序性细胞死亡7（PDCD7）基因是miR-134的潜在靶标。外源表达miR-134降低OSCC细胞中PDCD7表达，外源性表达miRZip-134增加OSCC细胞中PDCD7的表达；另外，PDCD7表达抑制了OSCC细胞的致癌性。通过基因编辑技术敲除PDCD7增加了裸鼠体外致癌性和颈部淋巴结转移，并降低了E-钙粘蛋白（E-cad）的表达。PDCD7通过启动子中的GC盒反式激活E-cad表达。此外，PDCD7减弱了miR-134相关的细胞转化和E-cad下调。在OSCC肿瘤组织中观察到PDCD7和E-cad的下调和高水平的miR-134表达。miR-134-PDCD7-E-cad 发病机制级联的激活发生在人和小鼠口腔癌变的早期阶段。总之，miR-134在口腔癌中的致癌作用是通过降低PDCD7和E-cad的表达来介导的。

技术路线：

研究结果：

1. miR-134在OSCC细胞中以PDCD7为靶点

图1. miR-134在OSCC细胞中靶向PDCD7。（a）外源miR-134在OSCC细胞亚克隆中表达。（b，c）外源miR-134稳定表达增加了OSCC细胞的生长和迁移。（d，e）外源miR-134瞬时表达增加了BrdU标记的细胞群和OSCC细胞的侵袭。（f，g）外源miRZip-134表达抑制OECM1细胞的增殖和迁移。（h，i）miR-134对PDCD7的3'UTR的作用导致WtR细胞中PDCD7活性降低; 然而，PDCD7活性在MutR的细胞中恢复。（j）外源miR-134表达降低OSCC细胞中的PDCD7表达，而miRZip-134表达增加OECM1细胞中的PDCD7表达。（k）OSCC细胞系中miR-134，PDCD7和E-cad表达的分析。（l）Heatmap blot，OSCC细胞系中miR-134，PDCD7和E-cad表达之间的相关性。

2. PDCD7抑制OSCC细胞的增殖和迁移，miR-134- PDCD7调控E-cad表达

图2. miR-134下调OSCC细胞中PDCD7和E-cad的表达。（a）外源表达PDCD7抑制OECM1细胞的生长（上图），BrdU标记的细胞群（中图）和迁移（下图）。（b，c）左图，细胞生长测定;右图，迁移试验。（d-g）WB分析。（h）免疫荧光。（b，h）OECM1细胞;（c）FaDu细胞;（d，e）OECM1和FaDu细胞;（f，g）OECM1和SAS细胞。（b）外源性PDCD7在对照和表达miR-134的OECM1细胞中的表达。（c）外源性PDCD7在对照和表达miR-134的FaDu细胞中的表达。（d）外源miR-134表达降低OSCC细胞中的PDCD7和E-cad表达。（e）miR-134抑制剂处理时增加OSCC细胞中的PDCD7和E-cad表达。miR-134调节的β-连环蛋白和波形蛋白的变化不一致。（f）外源性PDCD7表达增加OSCC细胞中的E-cad表达。（g）外源性PDCD7表达可恢复mi-134介导的对E-cad的抑制。（h）OECM1细胞主要在细胞核中观察到内源性和外源性PDCD7免疫荧光。

3.敲除PDCD7增加OSCC细胞的迁移并减少E-cad表达

图3. 敲除PDCD7增加了OSCC细胞致癌表型并降低E-cad表达。对OECM1细胞和SAS细胞及其敲除PDCD7细胞亚克隆进行分析。（a，c）OECM1细胞;（b，d，e）SAS细胞;（f - h）OECM1和SAS细胞。（a，b）上图，细胞生长测定;下图，典型的倒置显微镜图像。（c，d）上图，迁移试验;下图，在transwell膜下表面使用DAPI标记的细胞核的代表性图像。DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐。（e）侵袭试验。对SAS细胞及其敲除PDCD7的细胞亚克隆进行分析。（f）qRT-PCR分析以检测E-cad的mRNA表达。（g，h）蛋白质印迹分析。敲除PDCD7后E-cad和活性β-连环蛋白表达降低；外源表达PDCD7后E-cad表达增加。除了SPDCD7 CR 2-4之外，所有细胞亚克隆中均观察到外源表达PDCD7后β-连环蛋白的表达增加。

4. PDCD7通过调控GC-Box增加E-cad启动子活性

图4.E-cad启动子报告基因测定和ChIP测定。（a-d）野生型E-cad启动子报告基因测定。（e）E-cad启动子中缺失报告基因构建体的示意图。（f）检测缺失构建体。（a，b，d - h）OECM1细胞。（c）FaDu细胞。（a，f）外源性表达PDCD7。（b）表达miR-134。（c）抑制miR-134。（d）敲除PDCD7。（g，h）ChIP测定。（g）PCR产物的凝胶电泳图像。（h）ChIP qPCR分析。

5. miR-134-PDCD7-E-cad在小鼠口腔癌中的激活

图5. miR-134-PDCD7-E-cad致癌轴在小鼠化学致癌模型和原位颈部转移模型中的调节。（a - d，f）4NQO诱导的小鼠舌肿瘤发生模型。（g -i）NOD-SCID小鼠的原位颈部转移模型。（a）与未处理的对照组织相比，癌前病变（16周）和肿瘤病变（28周）中的miR-134染色和PDCD7和E-cad免疫反应性。对照组织，×100;病变组织，×200。（b-d）miR-134，PDCD7和E-cad定量分析。（e）在各种OSCC细胞系中，用4NQO处理均增加miR-134表达。（F）Heatmap blot表明小鼠口腔组织中miR-134，PDCD7和E-cad之间表达的相关性。（g）来自SAS细胞或SPDCD7 CR2-2细胞亚克隆的舌癌和颈部淋巴结病变原发肿瘤的典型病理组织学切片。虚线环绕颈部转移病灶。（h，i）肿瘤体积的定量（左图）和转移率（右图）。（h）所有肿瘤。（i）肿瘤大小< 10 mm³。

6. miR-134-PDCD7-E-cad在人类OSCC中的激活

图6. miR-134-PDCD7-E-cad在人类OPMD和OSCC组织中的状态。（a，b）OPMD。 （c - g）OSCC。（a，c）miR-134染色和PDCD7和E-cad在OPMD和OSCC组织阵列中的免疫反应性。上图，病变表现出强miR-134染色和相对较低的PDCD7和ECAD免疫反应;下图，病变表现出弱miR-134染色和相对较高的PDCD7和E-cad免疫反应。OPMD，× 200; OSCC，× 100。（b）左图，miR-134，PDCD7和E-cad定量分析。中图，heatmap blot表明OPMD中miR-134，PDCD7和E-cad表达之间的相关性。右图，PDCD7与E-cad表达的相关性分析。（d）OSCC组织阵列中miR-134，PDCD7和E-cad评分前后图。（e）左图和（f）heatmap blot分别说明OSCC组织阵列中miR134/PDCD7/E-cad表达之间的相关性，以及miR134/PDCD7/E-CAD/WWOX在组织对中的表达。（e）右图，组织阵列中PDCD7和E-cad表达之间的相关性分析。（g）总生存期（左图）和无病生存期（右图）。比较具有高miR-134表达水平和低PDCD7或E-cad表达水平的OSCC肿瘤，以及具有相反表达谱的肿瘤。OS，整生存期；DFS，无病生存期。

结论：

该研究阐明了在口腔癌中miR-134靶向PDCD7以驱动致癌性，并且PDCD7反式激活E-钙粘蛋白表达。在小鼠模型中，PDCD7的敲除增加了口腔癌异种移植物的淋巴结转移。 miR-134-PDCD7-E-cad调节轴的激活发生在口腔癌发生的早期阶段。 这项工作显示miR-134抑制和PDCD7诱导对口腔癌消除的潜力。

参考文献：Shih-Yuan Peng , Hsi-Feng Tu, Cheng-Chieh Yang, Cheng-Hsien Wu,Chung-Ji Liu,Kuo-Wei Chang , Shu-Chun Lin. miR-134 targets PDCD7 to reduce E-cadherin expression and enhance oral cancer progression. International Journal of Cancer. 2018 Jul