表观遗传又取得颠覆性进展啦！PVT1启动子可以作为独立的肿瘤相关DNA元件

2018年5月3日，表观遗传大牛张元豪课题组再度在顶级科学期刊Cell上发表题为“Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element”重磅研究，研究人员提出PVT1编码致癌lncRNA，但人类癌症中复发性易位和缺失可能是另一种机制。之前的研究表明PVT1编码致癌lncRNA，但人类癌症中复发性易位和缺失可能是另一种机制。在这里，研究人员显示PVT1启动子具有独立于PVT1 lncRNA的肿瘤抑制功能。 PVT1启动子的CRISPR干扰增强了乳腺癌细胞的竞争和细胞增殖。PVT1和MYC致癌基因的启动子位于染色体8q24上55kb处，竞争性结合PVT1基因座中的四个基因内增强子，从而允许PVT1启动子调节暂停释放MYC转录。PVT1经历发育调控的单等位基因表达，且PVT1启动子仅通过启动子竞争从相同染色体抑制MYC表达。癌症的基因组测序鉴定包含人类PVT1启动子的复发突变，并且基因组编辑证实PVT1启动子突变促进癌细胞生长。综上，lncRNA基因的调控序列（如本文的PVT1启动子）可以作为潜在的疾病相关DNA元件。

技术路线

结果

图1 CRISPRi干扰PVT1促进肿瘤细胞增殖与竞争

A. PVT1在基因组上的6个转录起始位点的位置；B. 基因组CRISPRi干扰TSS区，只有TSS1与TSS2区干扰后能促进细胞的增殖；C. 在MDA-MB-231细胞中的竞争实验表明，干扰PVT1后细胞的竞争能力增强，且克隆形成表现出星状的侵袭形态；D. In vivo的动物模型也表明CRISPRi干扰PVT1促进肿瘤细胞增殖。

图2 CRISPRi干扰PVT1促进MYC的表达

A,B. CRISPRi干扰PVT1，通过RNA-seq检测到MYC的RNA上调幅度最大,WB也验证了MYC在蛋白水平上增长了2~3倍；C. 设计PVT1 TSS1的上下游sgRNA,发现下游的sgRNA才能逆转PVT1与MYC的表达；D,E. siRNA介导的MYC mRNA的降解恢复了CRISPRi-PVT1的增殖优势F PVT1沉默细胞的细胞生长会增加MYC表达。

图3 解耦PVT1启动子与PVT1 lncRNA在MYC表达与增殖中的作用

A. 全长的PTV1的dCAS9干扰与dCAS9-KRAB干扰能相同的影响PTV1的表达，但并不能增加MYC的表达与增殖；B,C. 同样的，ASO以及siRNA能在RNA水平上沉默PVT1，但并不能增加MYC的表达与增殖。

图4 启动子竞争是PVT1与MYC对抗的基础

A,B. H3K27的HiChIPPVT1和MYC致癌基因的启动子位于染色体8q24上55kb处，竞争性结合PVT1基因座中的四个基因内增强子822E, 866E, 912E, and 919E,同时在MCF7细胞内也印证了这一点；C. 这些增强子在MDA-MB-231细胞中的CRISPRi降低了MYC和PVT1 mRNA的水平，表明内源性PVT1增强子调控了这两个基因；D,E. ChIP-qPCR实验表明CRISPRi-PVT1在PVT1启动子上减少了BRD4的占用，但在MYC启动子上显著增加了BRD4的占有率,同样的Pol II-S5P的占有率也呈现同样的趋势；F,G. CRISPRi-PVT1降低了PVT1的Pol II-S2P却促进了MYC的转录暂停后的延伸，4sU标记的新生RNA的转录也呈现同样的竞争趋势。

图5 PVT1启动子可逆地调控MYC转录

A,B. 利用dCAS9-VP64增强PVT1的转录，发现MYC mRNA的表达水平下调；C~F. PVT1的CRISPRa 能减少MYC启动子对BRD4的占有率以及减少 MYC Pol II 的延伸以及新生RNA的合成。

图6 单等位基因的PVT1启动子顺式调控了MYC表达

A. 以等位基因特异性表达模式分离单克隆，分析染色体重排，组蛋白修饰与RNA转录；B. 在mESC向mNPC分化的过程中，PVT1呈现由双等位基因转录到单等位基因转录的变化,并且单等位基因的PTV1启动子的激活抑制了MYC的染色体重排；C. 单等位基因的PVT1启动子顺式调控了MYC表达在多种mNPC克隆；D. 染色体重排的PTV1启动子的d-score与MYC mRNA的d-score是呈现拮抗的趋势，D,E也说明了这一点。

图7 癌症的基因组测序鉴定包含人类PVT1启动子的复发突变

A. PVT1启动子的DNA序列在TSS1与TSS2高度保守，此序列的波动会引起很严重的损伤；B,C. PVT1的启动子区域相较于其他lncRNA的启动子具有更明显的结构变化（SVs),同时在乳腺癌里也具有此现象；D,E,F. 癌症的基因组测序鉴定包含人类PVT1启动子的复发突变,并且基因组编辑证实PVT1启动子突变促进癌细胞生长。

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