microRNAs在内皮细胞中介导衰老相关的NRT2下调

氧化应激易导致多种衰老相关疾病的发生，如心血管疾病和癌症等。在衰老过程中，活性氧产生的增加通常伴随着氧化应激的适应性应激反应的下降。这种下降主要是由于抗氧化剂生产的减少。核因子E2相关因子2（NRF2）是调节氧化和亲电应激反应的关键转录因子，同时它也被证实在细胞代谢调控中发挥作用。NRF2在衰老过程中表达会下降，但机制尚不清楚。2018年6月22号Redox Biology（IF=7.126）杂志上发表了题为“MicroRNAs mediate the senescence-associated decline of NRF2 in endothelial cells”的论文，在这项研究中发现，在老内皮细胞丰富的microRNA（miRNA）通过直接靶向NRF2 mRNA从而降低NRF2表达。这种现象在miRNA抑制剂作用下会逆转。与衰老相关的NRF2下调会降低内皮糖酵解活性和应激耐受性，两者在恢复NRF2表达后也会恢复。操纵与衰老相关miRNA水平与NRF2结果一致也会影响糖酵解活性和应激耐受性。本研究结论是衰老相关miRNA会使NRF2的表达下降，从而有助于抑制细胞衰老过程中的适应性反应。

技术路线

结果

1. NRF2在衰老的内皮细胞中表达下降。

图1. NRF2在衰老的内皮细胞中的表达下降

A. qPCR 检测NRF2 表达基因、核因子、Erythroid 2 Like 2 (NFE2L2) (n=3)以及NRF2在年轻(p4)和衰老(p16) HUVECs中的WB检测。B. NRF2靶基因HMOX1在年轻 (p4) 和衰老 (p16) HUVECs中的表达。C. NFE2L2 和HMOX1 的mRNA (n=6) in oxPAPC处理后的细胞(30 μg/ml, 10 h)中的表达. 差异倍数是根据各自的对照值计算的。(所有数据：平均值 ± SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

2.在衰老内皮细胞中增加NRF2表达可恢复糖酵解过程。

图2. NRF2过表达恢复糖酵解活性和耐受性

A-B. 糖酵解压力测试在年轻 (p4, p8)和衰老的(p12, p16) HUVECs中 (A) and NRF2过表达HUVECs中(B). 数据用细胞外酸化率(ECAR)表示，归一化为蛋白浓度。糖酵解速率是细胞在加入饱和葡萄糖后所达到的ECAR速率。糖酵解能力是加入寡聚霉素后细胞群达到的最大ECAR速率，它能抑制氧化磷酸化。值得注意的是，（B）的结果来自于单独运行，因此不能将样品之间的值进行比较。(所有的数据:平均值 ± SEM, n=5, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

3.增加NRF2表达不能恢复衰老内皮细胞的增殖。

图3. 过表达NRF2和信号通路激活没有恢复增殖能力

年轻(p4) 和衰老(p16) 的(A), 衰老(p16) NRF2过表达的 (B)，和衰老(p16) oxPAPC处理过(C)的 HUVECs中细胞增殖和基因表达。A. 增殖和qPCR的差异倍数是根据年轻细胞的值计算的 (增殖：n=18 ，qPCR ：n=9)。B. 增殖和qPCR的差异倍数是根据对照组年轻和衰老细胞的值计算的(增殖：n=48，qPCR ：n=6). C. 增殖和qPCR的差异倍数是根据oxPAPC对照组年轻和衰老细胞的值计算的 (增殖：n=36，qPCR ：n=3)。(所有的数据：平均值±SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

4.在衰老的内皮细胞中存在着丰富的microRNAs，衰老相关的microRNAs靶向 NRF2。

图4. miRNAs有助于衰老相关的NRF2下降

A. 在正常HUVECs（n＝4）中miR21、miR100和mi-126的标准化microRNA测序数据（每百万个标签，TPM）。“Top 50”显示了数据中50个最丰富的miRNA的平均值。B. 用生物素化miRNA进行miRNA-126、miR21、mi-100和CEL-miR-39（对照miRNA，ctrl）的Pull-down 测定。NRF2的富集是根据对照（CEL-miR-39）值的差异倍数（n＝8）计算的。C. 在HUVECs中转染miRNA-126、miR21、miR-100和miR-34类似物进行NRF2进行WB实验，用于miRNA的过表达和miRNA抑制剂。对照（CTRL）指miRN类似物和抑制剂（P6，n＝3）各自的对照。D. NFR2在miRNA沉默的衰老（p16）HUVEC中的表达（qPCR：n＝9；Western blot：n＝3）。根据各自的对照组计算差异倍数。显示一个代表性的WB实验。E. miRNA过度表达年轻（P4）HUVECs中糖酵解应力测试（n＝10）。计算数据为胞外酸化速率（ECAR）归一化蛋白浓度，并根据类似物对照值计算差异倍数。F. NFR2靶基因NQO1在基础条件下抑制miRNA和oxPAPC处理过miRNA过表达的衰老（P12）HUVECs中的表达。抑制剂的结果是根据抑制剂的对照计算的，类似物的值是根据基础条件下类似物对照计算的。线表示在基础条件下抑制剂/类似物对照的表达。（所有条形图：平均值±SD，*p＜0.05，*p＜0.01，*** p＜0.001）。

参考文献：Kuosmanen, S. M., Sihvola, V., Kansanen, E., Kaikkonen, M. U., & Levonen, A. L. (2018). MicroRNAs mediate the senescence-associated decline of NRF2 in endothelial cells. Redox Biology.