雄激素受体阴性诱导长链非编码RNA ARNILA与miR-204结合促进三阴性乳腺癌的侵袭和转移

雄激素受体（AR）正在成为三阴性乳腺癌（TNBC）中一种新的预后生物标志物，但潜在的机制尚不清楚。近日发表在《Cell Death & Differentiation》(IF=8.0)的文章《An androgen receptor negatively induced long non-coding RNA ARNILA binding to miR-204 promotes the invasion and metastasis of triple-negative breast cancer》探究了这一机制。由于越来越多的证据表明长链非编码RNA（lncRNA）调节重要的癌症标志物，故假设AR调节的lncRNA可能在TNBC进展中发挥作用。在三种TNBC细胞系（MDA-MB-231、Hs578T和MDA-MB-436）中进行了双氢睾酮（DHT）处理或不处理的实验，鉴定了AR阴性诱导的lncRNA（ARNILA），其与TNBC患者的无进展生存期（poor progression-free survival PFS）相关并促进上皮-间质转化（EMT）、体内外侵袭和转移。随后，证明了ARNILA作为miR-204的竞争性内源RNA（ceRNA）起促进其靶基因Sox4的表达的作用，已知该靶基因可诱导EMT并促进乳腺癌发展，从而促进TNBC的ENT、侵袭和转移。这项研究结果不仅为lncRNA调节AR的机制提供了新的见解，而且还提出ARNILA作为抑制TNBC患者转移的替代治疗靶点。

技术路线

结果

1. AR的阳性表达与TNBC较好的预后相关。

图1 TNBC中的AR表达和与存活的关系

a 88例TNBC患者AR表达水平与PFS（logrank检验）的相关性。b 来自Kaplan.Meier Plotter（http：//www.kmplot.com / analysis /）的基底样乳腺癌中RFS与AR表达水平之间的相关性（logrank测试）。c AR阳性组与AR阴性组PFS风险比的森林图。d 来自TCGA数据库的AR mRNA水平，包括14个TNBC肿瘤和与其成对的正常组织。

2. AR阴性诱导的lncRNA（ARNILA）的鉴定。

图2 ARNILA的鉴定

a 用或不用DHT处理的MDA-MB-231，Hs578T和MDA-MB-436细胞的lncRNA微阵列数据的热图展示（差异倍数≥2.0，P <0.05）。b 通过用或不用DHT处理的MDA-MB-231，Hs578T和MDA-MB-436细胞的qRT-PCR测定ARNILA的表达。c FISH图像显示ARNILA在MDA-MB-231和Hs578T细胞的定位。d 上：TNBC患者的石蜡包埋组织中ARNILA和AR的典型FISH图像。下：88例TNBC患者中ARNILA和AR表达的关系。e 88例TNBC患者中ARNILA表达水平与PFS的相关性（对数秩检验）。f 上：ANRILA启动子内的引物对位置。下：在MDA-MB-231和Hs578T细胞中ARNILA启动子上AR丰度的ChIP测定。阳性和阴性对照分别表示为input和IgG。结果表示为平均值±SD。* P <0.05，** P <0.01。

3. ARNILA作为miR-204的ceRNA起到促进Sox4表达的作用。

图3 ARNILA通过结合miR-204上调Sox4

a 根据miRanda软件预测的最大分数得出的结合ARNILA的前十个预测的miRNA。根据Kaplan-Meier法推测的未治疗TNBC患者中miRNA表达和OS之间的关系（对数秩检验）。b 根据Kaplan-Meier法推测的TNBC患者AR表达水平与OS之间的关系（对数秩检验）。根据自动选择最佳截止值将患者分为低和高AR表达。c 左：miRanda软件推测的ARNILA 3'UTR中的miR-204 MRE。种子序列以粗体表示，突变体序列以红色表示。右：转染特定的miRNA类似物后293T细胞中ARNILA-Wt和ARNILA-Mut的荧光素酶活性。数据表示为海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性之比。d 左：由TargetScan数据库推测的Sox4的3'UTR中的miR-204 MRE。种子序列以粗体表示，突变体序列以红色表示。右：转染特定的miRNA类似物后293T细胞中Sox4-Wt和Sox4-Mut的荧光素酶活性。数据表示为海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性之比。e，f 左：miR-204类似物（e）或抑制剂（f）转染后MDA-MB-231和Hs578T细胞中Sox4表达的WB分析。右：左图中显示的蛋白质水平的量化。g 上：特定质粒转染后MDA-MB-231和Hs578T细胞中Sox4表达的WB分析。下：上图中显示的蛋白质水平的定量。h 上：特定质粒转染后Hs578T细胞中Sox4表达的WB分析。下：上图中显示的蛋白质水平的定量。结果表示为平均值±SD。* P <0.05。NS表示无显著性差异。

4. Sox4与AR呈负相关，并预测TNBC的临床结果不佳。

图4 Sox4与AR和高生存率呈负相关

a 左：特定处理后MDA-MB-231和Hs578T细胞中AR和Sox4表达的WB分析。中间和右侧：左图中显示的蛋白质水平的量化。结果表示为平均值±SD。* P <0.05。b 151例TNBC患者TCGA数据库中AR和Sox4的表达。c 根据Kaplan-Meier法推测的TNBC患者Sox4表达水平与RFS之间的关系（对数秩检验）。d 上：TNBC患者石蜡包埋组织中AR和Sox4的典型IHC图像。下：88例TNBC患者中AR和Sox4表达的相关性。e 88例TNBC患者的Sox4水平与PFS之间的关系（对数秩检验）。f 88例TNBC患者AR-Sox4结合水平与PFS的关系（对数秩检验）。

5. ARNILA在体外促进迁移，侵袭和EMT。

图5 ARNILA促进体外迁移，侵袭和EMT

a 上：特定的转染后MDA-MB-231和Hs578T细胞的创伤修复检测。下：上图中细胞伤口愈合的量化。b 上：特定的转染后的MDA-MB-231和Hs578T细胞的穿膜实验。下：膜下方迁移细胞的定量。c 左：特定处理后，MDA-MB-231和Hs578T细胞中E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白表达的WB分析。中间和右侧：左图中显示的蛋白质水平的量化。结果表示为平均值±SD。* P <0.05。

6. Sox4负责ARNILA介导的体外迁移，侵袭和EMT。

图6 Sox4负责ARNILA介导的体外迁移，侵袭和EMT

a 左：特定的转染后MDA-MB-231和Hs578T细胞的创伤修复检测。右：左图中细胞伤口愈合的量化。b 下：特定转染后的MDA-MB-231和Hs578T细胞的穿膜实验。上：下图中细胞迁移的量化。c 左：特定处理后，MDA-MB-231和Hs578T细胞中E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白表达的WB分析。右：左图中显示的蛋白质水平的量化。结果表示为平均值±SD。* P <0.05。NS表示无显著性差异。

7. ARNILA促进体内乳腺癌转移。

图7 ARNILA促进体内转移

a 注射18F-FDG 1小时后小鼠的典型PET/CT图像。肺和肝转移用白色箭头表示。b 两组肺和肝转移的发生率（Fisher's exact t检验）。c 分离的肺部明视野成像（上图）和苏木精和伊红染色（中部和下部）的肺和肝脏中转移性囊肿的典型图像。用黑色箭头表示肺和肝转移。d TNBC中基于ARNILA的信号传输路线示意图。在AR-positive TNBC（左）中，AR通过作为转录抑制因子显著抑制ARNILA；因此，ARNILA的海绵状功能由于其低表达水平而在这里很弱，并且miR-204被释放以抑制Sox4。在AR-negative TNBC（右）中，由于AR的抑制减少，miR-204主要由ARNILA消耗，因此Sox4以高水平表达。