血清外泌体介导精氨酸酶1作为糖尿病内皮功能障碍的新机制

内皮细胞功能障碍在糖尿病血管疾病中起着至关重要的作用，但其机制尚不完全清楚。外泌体通过在细胞间传递分子参与细胞通信。内皮细胞对血清外泌体的反应以及糖尿病相关血管疾病影响还没有相关报道。7月17日香港中文大学深圳研究所黄聿研究组在Proc Natl Acad Sci USA（IF=9.5）上发表论文，他们通过对糖尿病Db／Db小鼠血清中的外泌体进行纯化和鉴定，观察到这些性激素进入非完整糖尿病大鼠主动脉内皮细胞，内皮依赖性舒张功能受损。进一步的研究表明，外周体精氨酸酶1最有可能成为糖尿病血管疾病的调节剂。

技术路线

研究结果
1.dp/dp 小鼠血清中分离的外泌体进入内皮细胞。

图1.外泌的分离及其被内皮细胞吸收。

A.外泌体电镜鉴定。B.外泌体粒径密度分布分析。C.WB鉴定外泌体。D.PKH67和DAPI染色检测外泌体被内皮细胞吸收的情况。

2.从糖尿病小鼠中分离出的外泌体对非糖尿病小鼠动脉的内皮细胞产生损害。

图2. 从dp/dp小鼠中分离出的外泌体对dp/m+小鼠动脉的内皮细胞产生损害。

A. dp/dp小鼠血清外泌体高于dp/m+小鼠。B. 糖尿病小鼠血清外泌体的含量高于非糖尿病小鼠。C、D.外泌体抑制乙酰胆碱诱导的主动脉内皮依赖性舒张。E外泌体减弱了肠系膜动脉的内皮依赖性舒张。F. dp/dp和dp/m+来源的外泌体尾部注射入dp/m+小鼠，dp/dp 小鼠来源的外泌体对内皮依赖性舒张产生损害。G. PKH和DAPI染色显示肝素可以抑制内皮细胞对外泌体的吸收。H.肝素改善dp/dp小鼠外泌体诱发的内皮细胞功能障碍。

3.dp/dp小鼠外泌体中的外泌体蛋白在诱发内皮细胞功能障碍中起到了重要的作用。

图3. 外泌体蛋白在诱发内皮细胞功能障碍中起到了重要的作用。

A. 去除dp/dp小鼠的外泌体中蛋白质和RNA。B.电镜检测外泌体。C. WB检测外泌体。D.PCR分析不同方法处理后外泌体中各种miRNA的水平。E.外泌体中的蛋白质而不是RNA造成的血管内皮功能障碍。

4.dp/dp小鼠外泌体介导的精氨酸1（ARG1）水平的升高可以介导内皮细胞功能紊乱，且外泌体中的精氨酸1可以减少内皮细胞中NO的生成。

图4.糖尿病小鼠外泌体介导的ARG 1增加，并且参与了dp/dp小鼠外泌体对内皮细胞功能的损害。

A.WB检测外泌体相关蛋白。B.WB检测外泌体中Arg1和CD63蛋白的表达。C.外泌体中Arg1的活性要高于血清中的Arg1活性。D. dp/dp小鼠外泌体加入Arg1抑制剂于dp/m+小鼠的主动脉中。E.WB检测Arg1蛋白。F. dp/dp小鼠外泌体处理后精氨酸和鸟氨酸水平的检测。G. dp/dp小鼠外泌体处理后可以减少NO的产生。

5.在dp/dp小鼠内皮细胞中，外泌体是Arg1的主要来源。

图5. dp/dp小鼠和dp/dm+小鼠Arg1 蛋白和基因的表达。

A.荧光染色检测dp/dp小鼠和dp/dm+小鼠Arg1 蛋白表达。B. qPCR分析显示dB/m +和dB/db小鼠主动脉内皮细胞中Arg1和Arg2的mRNA表达水平。C. 在原位杂交中发现的db/db或db/m+肝、脾和主动脉的内源性Arg1表达。D.加入外泌体抑制剂后检测Arg1的表达。E. 用Arg1-shRNA体外敲除Arg1并不能挽救db／db小鼠主动脉内皮功能。F. 敲除Arg1-shRNA对db/db外泌体诱导的内皮功能障碍的影响。

6.ARG1敲除恢复了db/db小鼠的内皮细胞功能。

图6.敲除Arg1提高db/db小鼠的EDRS。

A. 免疫荧光图像显示，在db/db小鼠主动脉内皮细胞中Arg1蛋白表达。B. 敲除Arg1可以恢复血管依赖性舒张。C、D：敲除Arg1增加了db/db小鼠主动脉的亚硝酸盐水平。E.WB检测Arg1蛋白表达。F. 敲除Arg1后的db/db小鼠外泌体注射入dB/m +小鼠，其EDRS功能没有损害。

7.体内ARG1过表达导致db/m+小鼠内皮功能障碍。

图7.Arg1过度表达损害db/m+小鼠内皮功能。

A. 免疫荧光图像显示在db/M+小鼠主动脉内皮细胞中ARG1蛋白表达。B、C、D Arg1过度表达减弱EDRS，这种效应可以被L-精氨酸逆转。E.WB检测Arg1和CD63蛋白水平。F. 从AG1过度表达的db/m+小鼠中分离出的外泌体蛋白在4~8小时孵育后，db/m+小鼠主动脉中触发内皮功能障碍。G. 外泌体在糖尿病相关内皮功能障碍中的作用。