乳腺癌中XIST下调可以激活MSN-c-Met信号通路并且低表达XIST乳腺癌来源的外泌体miR-503能够重新编码小神经胶质细胞，最终促进乳腺癌的颅内转移的发生

高于30%的转移性乳腺癌病人最终会发展成为颅内转移，但是这是如何发展的，其病理机制还不是很清楚。鉴于此，Kounosuke Watabe教授带领其团队探究了乳腺癌的颅内转移的过程，并于2018年7月19日发表于Cancer Research杂志（IF=9.1）。本次研究首先在原发性乳腺癌组织和乳腺癌的颅内转移肿瘤组织做了lncRNA表达谱，并发现X-inactive–specific transcript（XIST）在这两种组织中下调最显著。然后作者进行了XIST功能的探究，发现XIST表达水平与颅内转移存在负相关性，但是与骨转移没有相关性。当沉默XIST后能够优先促进异种移植模型中的颅内转移瘤的生长。进一步，作者在小鼠乳腺中特异性敲除XIST，发现这能加速原发性乳腺癌肿瘤的生长和颅内转移的发生。同时，下调XIST能够通过MSN调节蛋白刺激上皮间质转换（EMT）和激活c-Met，这便会增加肿瘤细胞多能性。下调XIST也能够分泌携带miR-503的外泌体，这能够启动小神经胶质细胞M1-M2的极化。M1-M2的改变能够增加小神经胶质细胞中免疫抑制因子的表达，最终抑制T细胞的增殖。作者又进一步筛选了FDA-批准的药物库，并且识别了氟达拉滨可以作为低表达XIST的乳腺癌的合成致命药物，并且还发现氟达拉滨能够在小鼠模型中抑制乳腺癌的颅内转移。

这篇文章的结果揭示了XIST通过影响肿瘤细胞和肿瘤微环境，最终在乳腺癌的颅内转移中具有关键性的作用。同时，XIST调节的信号通路也可能作为治疗乳腺癌的颅内转移的有效靶点。

技术路线

结果
1. XIST在乳腺癌的颅内转移中的表达是下调的。

图1. X染色体上的XIST的下调与颅内转移正相关。

A. 样品示意图和lncRNA分析（原发性乳腺癌组织点（n=11）、乳腺癌的颅内转移组织点（n=13）被切下，显微切割去得到肿瘤细胞，提取RNA，检测92个关键的与癌症相关的lncRNA）。B. TaqMan PCR检测XIST在临床样本中的表达。 C. qPCR检测在两对优先转移颅内的细胞系中XIST的表达。D. 通过GEO数据库，Kaplan–Meier分析颅内转移的病人与死亡的关系（n=710）。E. 通过GSE14018数据库检测发生肿瘤转移乳腺癌病人中XIST的表达。F. 通过TCGA据库检测亚型乳腺癌病人中XIST的表达。

2. 在体内，XIST优先抑制肿瘤的颅内转移。

图2. 在体内，下调XIST能够促进肿瘤的颅内转移。

A-H. 正常或下调XIST的MCF7和SKBR3注射到小鼠心脏中。qPCR检测MCF7和SKBR3细胞下调XIST的效率（A、E）。下调XIST后，每一周检测一次luciferase信号反应肿瘤生长情况（B、F）。Kaplan–Meier分析颅内转移和生存之间的关系（C、G）。28天后处死小鼠，大脑内的luciferase信号被检测（D、H）。I. qPCR检测231BrM-dXIST#11的表达。 J-L. 通过心脏注射，将231BrM-dCTRL和231BrM-dXIST#11细胞接种到裸鼠体内，监测肿瘤生长（J）。Kaplan–Meier分析颅内转移和生存之间的关系（K）。28天后处死小鼠，大脑内的luciferase信号被检测（L）。M. 正常或下调XIST的MCF7和ZR75-1细胞原位移植裸鼠乳房脂肪垫中，通过BLI检测原发性肿瘤的生长。N. 移植5周后检测颅内转移发生率。O. 通过心脏注射将MCF7-shCTRL 和 MCF7-shXIST细胞转移到裸鼠大脑中，通过lVlS检测肿瘤生长。P. 来自肿瘤模型的小鼠的大脑的量化。

3. 乳腺特异性敲除XIST能够提高颅内转移。

图3. 在MMTV-PyMT模型中敲除XIST后促进颅内转移。

A. 正常表达和敲除XIST的乳腺的图片（Age=3W）。B. A图中乳房的肿瘤结节被统计。C. 20周后计算肿瘤的体积。D. IHC检测来自正常表达和敲除XIST的PyMT小鼠的原发性肿瘤中CK14和CK8/18的表达。E. 正常表达和敲除XIST的MMTV-PyMT的肿瘤远距离转移率。F. 24-28周，ICH检测CK14和mT-抗原显示肿瘤的微转移率。G. 小鼠大脑微转移的数量。H. qPCR检测mT-抗原在小鼠大脑中的表达。I. Kaplan–Meier 分析颅内转移和Py216 and Py222细胞孵育的C57/B6小鼠生存率的关系。J. 28天后处死小鼠，大脑内的luciferase信号被检测。K. 苏木精和尹红染色孵育Py222细胞的小鼠颅内转移瘤。

4.下调XIST能够促进肿瘤EMT和多能性。

图4.下调XIST启动子促进肿瘤EMT和多能性。

A. MCF7-shXIST 和 ZR75-1-shXIST细胞在形态学上改变的图片。B-E. qPCR（B）、WB（C）、免疫组化（D）检测EMT marker（E-cadherin 和vimentin）。E. 正常表达或下调的XIST后7天的MCF7 和ZR75-1细胞的形态学图片（左），球体的数量被统计（右）。F. 通过将MCF7-shCTRL和MCF7-shXIST细胞注射到裸鼠乳腺脂肪垫中，进行有限稀释实验检测肿瘤启动能力和测量肿瘤的形成。G. 正常表达或下调XIST的 MCF7 和 ZR75-1细胞进行移行分析实验。

5.下调XIST能够通过MSN的上调激活c-Met信号通路。

图5. XIST通过MSN调节c-Met的表达。

A. 在TCGA中乳腺癌病人被分为高表达XIST（高于30%）组和低表达XIST（低于30%）组，然后进行GSEA对119个促癌通路进行分析。结果显示HGF/c-Met通路的富集程度最高。B. WB检测正常表达或下调XIST的3种不同的乳腺癌细胞系中c-Met的表达。C. 在发生颅内转移瘤的病人中，TaqMan qPCR检测XIST的表达，IHC检测c-Met蛋白的表达。通过卡方计算2 XIST表达和c-Met表达的相关性。D. MCF7-shCTRL 和MCF7-shXIST 细胞的表达谱分析的流程图。E. qPCR检测MCF7-shCTRL 和MCF7-shXIST细胞中MSN、MID1 和MPP1的表达。F.在MCF7-shXIST 和SKBR3-shXIST细胞中下调MSN后，WB检测MSN和c-Met的表达。G. 免疫组化检测正常表达或下调XIST或MSN的MCF7细胞。H. 在231BrM细胞中下调MSN后，WB检测MSN和c-Met的表达。J. WB检测正常表达或下调XIST的231BrM和SKBrM3细胞中c-Met和MSN的表达。K. 免疫组化检测正常表达或下调XIST的231BrM细胞。L. WB检测加或不加四环素的MCF7-shXIST/Dox/sh-Met细胞中 c-Met的表达。M. 加或不加四环素的MCF7-shXIST/Dox/sh-Met细胞进行移行实验。N. 进行小鼠心脏接种MCF7-shXIST/Dox/sh-Met细胞，并且进行四环素治疗（将四环素加到小鼠的引用水中），分析大脑（左）和骨骼（右）内转移瘤和生存的关系。O. 最后进行BLI拍照。P. 来自于大脑和骨骼的内转移瘤小鼠模型中BLI的定量。

6.在脑中，低表达XIST的细胞能够分泌携带miR-503的外泌体，进一步重编码小神经胶质细胞。

图6. 来自低表达XIST细胞的外泌体能够携带miR-503逆转小神经胶质细胞从M1-M2极性表型的改变。

A.在低表达和高表达XIST的病人中，通过GSEA检测了来自MSigDB数据库的95个与免疫相关的信号通路。先天性免疫富集程度最高。C. qPCR检测加入或不加入外泌体的SIM-A9细胞中（小鼠小神经胶质细胞系）CD86和ARG1的表达。D. 外泌体miRNA的表达谱分析流程图。E. TaqMan-qPCR检测正常表达或下调XIST的两对肺癌细胞系中miR-503的表达情况。F. 从MCF-shXIST细胞培养基中分离外泌体然后进行含有PalmGFP的慢病毒载体进行荧光标记。外泌体共孵育SIM-A9细胞，检测小神经胶质细胞中的GFP荧光。G. 在患有乳腺癌的病人中，使用GSE22220数据库在复发和生存之见检测miR-503的表达。H. 使用Exoquick试剂盒提取发生颅内转移和未发生颅内转移的病人的血清中提取外泌体。提取外泌体中的RNA后，进行TaqMan qPCR检测miR-503的表达。I. 从MCF7-shCTRL, MCF7-shXIST 和MCF7-shXIST/Anti-miR503细胞的上清液中提取外泌体，孵育SIM-A9细胞后，qPCR检测M1(CD86)和M2(CD204,ARG1)的markers。J. qPCR检测表达或不表达miR-503的SIM-A9细胞中的M1(CD74,CD80,CD86)和M2(CD204,ARG1/2,IL10)的 markers。K. WB检测表达或不表达miR-503的SIM-A9细胞中p-STAT3, STAT3, p-p65 和p65。L. WB检测加入或不加入miR-503的SIM-A9细胞和人小神经胶质细胞（HMC-3）中PD-L1的表达。M. IHC检测乳腺癌的颅内转移瘤中PD-L1和IBA-1的表达。N. 加入或不加miR-503的SIM-A9与来自小鼠脾脏组织的祖T细胞共培养后，CFSE实验研究T细胞的增殖。

7.氟达拉滨能够抑制低表达XIST肿瘤细胞的生长。

图7. 氟达拉滨能够抑制低表达XIST乳腺癌细胞的生长。

A.在正常表达或下调XIST的MCF7细胞中，通过MTS实验检测FAD批准的药物库和化学药物库（分别包含1250和140个化合物）。B. 用不同浓度的氟达拉滨处理MCF7-shCTRL和MCF7-shXIST细胞进行克隆形成实验。C. 用不同浓度的氟达拉滨处理差异表达XIST的癌症细胞系。D. 在正常表达或下调XIST的231BrM细胞中进行克隆形成实验。E. 通过心脏注射，将MCF7-shXIST细胞注射到裸鼠体内后，进行氟达拉滨不处理或处理后，lVlS检测肿瘤的生长。F. Kaplan–Meier分析E中颅内转移瘤和生存之间的关系。G. 用氟达拉滨处理或不处理的小鼠颅内转移瘤进行HE染色。H. 在颅内转移瘤中XIST的下游效应。在癌症细胞中下调XIST能够促进EMT、通过MSN上调c-Met信号通路、外泌体分泌的miR-503上调。外泌体miR-503能够激活小神经胶质细胞并启动M1-M2的极性转换，这能够抑制T细胞的活性。