从心肌成纤维细胞中提取的外泌体mi423-3p介导缺血后处理对心脏的保护作用

  在冠状动脉疾病中，早期的缺血再灌注以及经皮冠状动脉介入治疗可以在一定程度上降低心肌梗死，但也会增加心肌缺血再灌注损伤（IRI）的风险。而缺血后灌注不仅可以减少IRI，也在一定程度上下调了心肌细胞凋亡。外泌体包裹的miRNA在心血管系统内的细胞间通讯有重要作用，心肌成纤维细胞（CFs）是心脏中数量最多的细胞，其是否通过分泌的外泌体中的miRNA在缺血后处理中起到对心肌的保护作用还有待研究。中南大学的罗慧博士通过建立transwell共培养系统，缺氧/复氧（H/R）可以促进CFs外泌体的产生，缺血后处理可以增强CFs外泌体对H/R细胞的保护功能。

技术路线

结果

1.心脏成纤维细胞分泌的外泌体保护H/R后H9C2细胞活性，且H/R-后处理可以增强这种保护作用。与常氧组相比，H/R后 H9C2细胞活性降低，H9C2细胞与成纤维细胞共培养时，细胞活性增加（图A）；WB检测细胞凋亡，H/R后，细胞凋亡增多，H/R后处理，细胞凋亡下降（图B）；GW-4869处理CFs,CFs中CD63阳性囊泡积累大于对照组和DMSO处理组（图C）；GW-4869可以明显降低CFs的活性（图D）；GW-4869处理后，细胞凋亡升高（图E）；HR-后处理可以增强CFs分泌外泌体对心肌的保护作用（图F，图G）

2.H/R和H/R后处理，从CFs细胞释放的外泌体可被H9C2细胞摄取。电镜鉴定外泌体（A）;NAT鉴定外泌体（B）;WB鉴定外泌体标志蛋白检测（C）;H/R和H/R后处理增强CFs外泌体标志蛋白的增加，H/R后处理可以进一步促进CFs分泌外泌体（D、E、F）；CFs分泌的外泌体（PKH26标记）可被H9C2细胞摄取（H,I）

3.H/R后CFs分泌的外泌体对心肌细胞具有保护作用。将H9C2细胞用PBS、H/R CFs分泌的外泌体、H/R后处理CFs分泌的外泌体处理，再进行H/R处理。H/R后处理CFs分泌的外泌体明显提高细胞生存率，降低细胞凋亡，其对心肌细胞的保护能力大于H/R CFs分泌的外泌体,H/R后处理可以增强体外循环中CFs外泌体对细胞的保护作用（A,B）;心肌梗死面积检测I/R后外泌体处理可以明显减少心肌梗死面积（C、D）；Tunel染色检测细胞凋亡（E、F）;I/R处理后，心肌胶原组织显著沉积，CFs外泌体可以明显减少胶原沉积（G）。

4.H/R-CFs-exo和H/R-后处理-CFs-exo  miRNA表达谱。miRNA测序，11个差异miRNA（A）;PCR验证差异miRNA;PCR验证CFs中miR-423-3p表达（B）；PCR检测CFs外泌体中miR-423-3P表达（C）；在心肌梗死区，miR-423-3p明显下调，且I/R-后处理逆转了这一效应（D）; I/R-后处理增加梗死边缘区miR-423-3p表达（E）; miR-423-3p表达在梗死区迎合梗死边缘区表达差异（F）; miR-423-3p在各组中的含量变化（G）； miR-423-3p过表达后检测各组miR-423-3p变化，以及各组细胞活性（H,I）;WB检测miR-423-3p过表达后细胞凋亡变化（J）。

5.下调miR-423-3P过表达可降低I/R后对心肌的保护作用。TTC染色检测心肌梗死面积，下调miR-423-3P过表达可以增加心梗面积（A,B）;TUNEL染色检测细胞凋亡（C）。

6.miR-423-3P通过靶向Rap2c保护H9C2细胞面授H/R损伤。H/R可以下调miR-423-3P的表达（A）;CCK-8检测细胞活性（B）; miR-423-3P对细胞凋亡的影响（C）;PCR验证miR-423-3P与靶基因Rap2c的关系（D）;双荧光素酶报告基因实验确定miR-423-3P与靶细胞Rap2c的关系（E）；PCR，WB检测 Rap2c在H/R后的表达变化（F,G）;SiRap2c检测细胞凋亡。