长链非编码RNA对巨噬细胞胆固醇流出和动脉粥样硬化的转录调控

核受体调节基因表达以响应环境因素，但控制核受体细胞类型特异性的分子事件仍然知之甚少。近日，Tontonoz和他的团队在Nature Medicine(IF=32.621) 发表题为Transcriptional regulation of macrophage cholesterol efflux and atherogenesis by a long noncoding RNA的文章，他们发现长非编码RNA（lncRNA）在调节肝X受体（LXRs）的细胞类型特异性作用中的作用，甾醇激活的核受体调节参与胆固醇体内平衡的基因的表达，并且已经因果关系对动脉粥样硬化的发病机制。他们将lncRNA MeXis鉴定为基因Abca1的LXR依赖性转录的放大器，其对于调节胆固醇流出是至关重要的。缺乏MeXis基因的小鼠以组织选择性方式显示减少的Abca1表达。此外，小鼠骨髓细胞中MeXis的缺失改变了Abca1基因座的染色体结构，损害了细胞对胆固醇过载的反应，并加速了动脉粥样硬化的发展。机理研究表明，MeXis与转录共激活因子DDX17的启动子结合相互作用并引导其结合。鉴定MeXis作为LXR依赖性基因表达的lncRNA调节剂扩展了对核受体在生理学和疾病中的细胞类型选择性作用的机制的理解。

技术路线

主要结果

1 巨噬细胞lncRNAs的表达被调控以应对胆固醇负荷

图1 LXR调节非编码RNA MeXis。

（a）顶部，来自综合基因组学查看器（IGV）上的MeXis基因座的数据。 底部，组蛋白标记来自MeXis基因直接区域的LICR ENCODE数据.（b ）ABCAI和MeXis表达Ctrl，GW3965和/或RXR配体处理的原代小鼠巨噬细胞。(c) 用Ctrl GW3965，氧化LDL或乙酰化LDL处理的原代小鼠巨噬细胞中MeXis表达的实时PCR分析。(d) 用Ctrl或GW3965处理的原代小鼠巨噬细胞中或用载体或GW3965处理的WT小鼠解剖的肝脏通过 灌胃连续三天分析MeXis和LeXis表达。(e) MeXis基因座LXR结合的ChIP-seq分析。(f) 用Ctrl或GW3965（0.5μM）处理的所示基因型小鼠的原代小鼠巨噬细胞中MeXis表达的实时PCR分析（载体处理的WT，LXRα-KO和LXRβ-KO; g 使用编码-非编码索引(CNCI)软件预测显示的lncrna的编码潜力。

2 MeXis是LXR-responsive lncRNA，影响Abca1表达

图2 MeXis对Abca1表达和功能的调节。

(a) 实时PCR分析GW3965和RXR配体LG26836 h处理后加siRNAs后MeXis和Abca1表达（巨噬细胞）。（b）在用载体或GW3965处理的RAW细胞中稳定过表达对照载体（Vect）或MeXis后10天的MeXis和Abca1表达分析。（c） 在载有[3 H]胆固醇的RAW巨噬细胞中存在ApoA-I时胆固醇流出，并用酰基辅酶A：胆固醇O酰基转移酶抑制剂和DMSO或LXR配体处理。（d） 实时荧光定量PCR检测初代小鼠巨噬细胞MeXis和Abca1的表达，检测小鼠心脏、肾脏、肝脏中Abca1的表达（e）免疫印迹分析,主要从WT /GW3965处理老鼠巨噬细胞ABCA1水平 (f) WT或MeXis−−/巨噬细胞胆固醇和酰基辅酶分析。（g）在小鼠中分离的腹膜巨噬细胞中测量的胆固醇含量。 （h）从WT或MeXis - / - 小鼠分离的腹膜巨噬细胞的油红O染色（氧化的LDL处理72小时）。（i）MeXis（Ad MeXis）的腺病毒载体转导小鼠的总血清胆固醇（j）用Ad-GFP或Ad-MeXis转导小鼠后6天肝脏中的基因表达（k）来自i小鼠的肝脏中ABCA1水平的左，Western印迹分析

3 MeXis 表达降低作用于Abca1表达、胆固醇流出、动脉粥样硬化

图3 MeXis的缺失会损害巨噬细胞Abca1的表达，加速动脉粥样硬化。

（a）具有动脉粥样硬化斑块的主动脉表面积的百分比（（b）来自a。主动脉的人脸分析的代表性照片。（c）从油红O染色的主动脉根部切片。（d）来自主动脉根部的冷冻切片的油红O染色剂。（e）用巨噬细胞标记物CD68和H＆E染色的主动脉根的代表性组织学。（f）激光捕获显微切割来自MeXis - / - 小鼠的CD68阳性细胞之前（左）和之后（右）的主动脉损伤的代表性图像。（g）实时PCR Abca1和MeXis表达

4 MeXis与DDX17相互作用，调节Abca1转录。

图4 MeXis改变Abca1位点的染色体结构。

（a）在原代小鼠巨噬细胞中Abca1基因座处的eRNA的基因表达（b）来自所示基因型的小鼠的原代巨噬细胞中Abca1 flox等位基因的表达。 （c）来自用DMSO对照或GW3965（1μM）处理3小时的WT或MeXis - / - 小鼠的原代小鼠巨噬细胞的ATAC-seq数据的基因组浏览器视图。（d）ATAC-seq分析显示在具有GW3965处理的WT或MeXis - / - 巨噬细胞中Abca1和Tlr4基因启动子周围的峰处的可及性。（e）WT和MeXis - / - 巨噬细胞中有或没有GW3965处理热图。

图5 确定DDX17和 MeXis相互作用。

（a）DDX17的左，RNA免疫沉淀（IP）分析。使用来自未处理（中间）或用交联剂甲醛（右）处理的小鼠腹膜巨噬细胞的IgG对照或DDX17抗体进行免疫沉淀后，通过以下方法测定MeXis，36B4（Rplp0），亲环蛋白（Ppia）和NEAT1的表达。（b）通过ChIP-qPCR分析确定来自WT或MeXis - / - 小鼠的小鼠巨噬细胞中Abca1基因座的DDX17和LXR的募集。（c）Abca1基因座上一系列ATAC-seq位点的ChIRP-qPCR分析。d）慢病毒转导的永生化BMDM（选择阳性细胞库）中DDX17水平的Western blot分析。（f）MeXis（左）和Abca1（右）在所示类型的永生化BMDM中的表达。（g）来自f的永生化BMDM中ABCA1和DDX17水平的Western blot分析。

5 LXR-MeXis轴在人体功能保守。

图6 LXR-MeXis轴在人体功能保守。

（a）MeXis基因座位上物种间的序列相似性。 （b）ABCA1（左）和TCONS00016111（右）在用DMSO（Ctrl）或GW3965（0.5μM）处理16小时的分化的THP-1单核细胞中的表达。（c）用指定的ASO（50nM）和GW3965（0.5μM）处理的分化的THP-1细胞中的ABCA1（右）和TCONS00016111（左）表达（每组n = 3）。（d）在用指定的ASO处理的THP-1细胞中存在ApoA-I时胆固醇流出，负载[3 H]胆固醇（1.0μCi/ ml），并用酰基辅酶A：胆固醇O酰基转移酶抑制剂和（DMSO或LXR配体）处理。（e）在用编码靶向MeXis（lenti anti）的ASO的对照慢病毒或编码MeXis（lenti MeXix）的慢病毒（每组n = 3）处理的MeXis - / - BMDM中的Abca1基因表达。（f）用对照或MeXis慢病毒处理的THP-1细胞中的Abca1表达。（g）来自CARDIoGRAMplusC4D联盟的TCONS-0016111变异区域协会图和人类冠状动脉疾病风险分析。