核lncRNA Charme的缺乏导致小鼠肌源性缺陷和心脏重塑

肌生成是一个高度调控的过程，它涉及到祖细胞转化为多核肌细胞。除了蛋白和miRNAs之外，lncRNA已经显示能够参与肌生成的调控。在2015年，Irene Bozzoni教授带领他的团队在肌的不同分化期做了RNA-seq分析，并发现了新的lnRNA ，Charme，这篇文章发表在了Molecular Cell Biology（IF=5.592）杂志。鉴于此，Irene Bozzoni教授带领他的团队进一步探究了Charme的特点与对肌生成的影响，并于2018年9月3日发表在EMBO（IF=10.557）杂志上。这篇文章，鉴定了Charme是一个染色体相关的lncRNA，它能够在体内体外促进肌源编程。在肌细胞中，Charme敲除后能够启动特异性染色体域的解体，在这其中，含有肌源性的基因会下调。特别要提的是， Charme能调节一些人心肌疾病相关的敏感基因。同时，小鼠Charme敲除后会导致心脏重塑表型的改变，如心脏的大小、结构、形状等。此外，人同源性Charme能够调节相同靶基因簇，它的存在对Charme来说是一个重要且保守的作用。总之，这些数据描述了一个例子，新的染色体相关的lncRNA能够调节心肌重塑。

技术路线                                   

结果
1. Charme是一个与染色体相关的lncRNA。

图1

A. Charme的基因结构。LNA GAPDH引物的位置： GAP-2, GAP-2/3。原位探针：绿色为内含子，红色为外显子。B. sqRT-PCR检测来自2天的去分化肌小管的细胞质、细胞核、核质或染色体片段中的pCharme和mCharme的表达。片段的质量用GAPDH和pre-GAPDH（前体RNAs）检测. C. MHC蛋白（绿色）和Charme RNA（红色）在全分化的肌小管共染。D. sqRT-PCR检测Charme在生长和分化条件下的表达情况。E. qRT-PCR检测GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr处理的分化的肌小管中的mCharme和pCharme、MCK、MHC的表达。F. GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr处理的C2C12细胞中MHC进行免疫荧光染色。G. 定量GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr处理的细胞中肌小管的形成。

2. Charme通过与nctc域相互作用调节肌形成

图2

A.RNA-seq分析Charme敲减后，转录本的改变。B. Charme敲减后，对上调或下调基因的GO富集分析。C. Charme敲减后，下调基因的KEGG富集分析。D. ChRIP实验：富集的RNA（左图）、富集的DNA（右图）。E. 2天的分化肌小管中，对Charme RNA 和nctc进行RNA/DNA FISH（左图）或lnc-31位点（右图）。（I）表示二维图片，（II）表示三维图片，（III）表示Z轴旋转。黄色箭头代表重叠信号。F. 在GAP-scr- 和GAP-2-转染的肌小管（2天分化）中，qRT-PCR检测Charme和Charme靶基因的表达。G. 在GAP-scr- 和GAP-2-转染的肌小管中，ChIP实验检测RNA Pol II（左）和H3K9ac（右图）。在GAP-scr- 和GAP-2转染的条件下，qPCR检测回复的染色体和基因间的表达。

3. Charme与nctc域物理性靠近

图3

A.在肌小管生长和分化（DM1）条件下，Charme和nctc（上方）的双链DNA和lnc-31位点（下方）的FISH实验。B. GAP-scr- 和GAP-2-转染的肌小管（DM1）中，Charme和nctc位点进行DNA/DNA FISH实验。

图4. Charme-/-小鼠的产生和展示的骨骼肌表型

A.上图： Charme位点和sgRNA1 and sgRNA2位置示意图；下图：单链ODN包含的2个同源性臂（灰线）100-nt-长的poly（A）/2×MAZ。B. qRT-PCR检测来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌匀浆中mCharme和pCharme的表达。C. 免疫荧光对来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌组织中肌营养不良蛋白进行染色。D. qRT-PCR检测来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌中MHC和MCK转录本的表达。E. qRT-PCR检测来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌中Tnnt3、Tnni2和Igf2转录本的表达。
 

图5. Charme-/-小鼠展示出心脏表型

A.qRT-PCR检测来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心脏匀浆中mCharme和pCharme的表达。B. 对1个月大Charme+/+小鼠（左图）和Charme-/-小鼠（右图）的心肌进行苏木精和尹红染色。C. 免疫荧光对来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中心脏组织中肌营养不良蛋白进行染色。D. qRT-PCR检测来自1个月的Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心脏匀浆中Myh7、Tnnt2和Igf2转录本的表达。E. 1天大的Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心脏组织中Charme和nctc位点的DNA/DNA FISH实验。

图6.人Charme的特点与功能

A.带有PCR引物（hs-2, hs-3)和LNA GAPmers (hs-GAP-int1, hs-GAP-ex2)的人Charme基因组位点。B. 在增殖（GM）和鉴别（3、6、10）条件下的健康和营养不良（DMD）源发性肌细胞中RT-PCR检测人hs-pCharme（上图）和hs-mCharme（下图）的表达。C. aqRT-PCR检测分化的肌小管中细胞质和细胞核中RNA片段中hs-pCharme和hs-mCharme的表达。D. PCR扩增分析hs-pCharme内含子1，对oligos的位置进行了描述。E. qRT-PCR检测用hs-GAP-int1、hs-GAP-ex2或hs-GAPscr GAPmers处理分化5天的原代细胞中hs-mCharme、hs-pCharme、MCK、MHC、Igf2、Tnnt3、Tnni2、和Dmd mRNAs水平的表达。F. pCharme行为模式图：在增生的成肌细胞中，Charme没有被表达，它的染色质位点在空间上与nctc区域相距遥远；在分化的肌小管中，pCharme稳定在两个位置的物理距离允许它们共同调控的表达式。