核lncRNA Charme的缺乏导致小鼠肌源性缺陷和心脏重塑
栏目:最新研究动态 发布时间:2018-09-25
肌生成是一个高度调控的过程,它涉及到祖细胞转化为多核肌细胞。除了蛋白和miRNAs之外......

肌生成是一个高度调控的过程,它涉及到祖细胞转化为多核肌细胞。除了蛋白和miRNAs之外,lncRNA已经显示能够参与肌生成的调控。在2015年,Irene Bozzoni教授带领他的团队在肌的不同分化期做了RNA-seq分析,并发现了新的lnRNA ,Charme,这篇文章发表在了Molecular Cell Biology(IF=5.592)杂志。鉴于此,Irene Bozzoni教授带领他的团队进一步探究了Charme的特点与对肌生成的影响,并于2018年9月3日发表在EMBO(IF=10.557)杂志上。这篇文章,鉴定了Charme是一个染色体相关的lncRNA,它能够在体内体外促进肌源编程。在肌细胞中,Charme敲除后能够启动特异性染色体域的解体,在这其中,含有肌源性的基因会下调。特别要提的是, Charme能调节一些人心肌疾病相关的敏感基因。同时,小鼠Charme敲除后会导致心脏重塑表型的改变,如心脏的大小、结构、形状等。此外,人同源性Charme能够调节相同靶基因簇,它的存在对Charme来说是一个重要且保守的作用。总之,这些数据描述了一个例子,新的染色体相关的lncRNA能够调节心肌重塑。


 

技术路线                                   

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结果
1. Charme是一个与染色体相关的lncRNA。

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图1

A. Charme的基因结构。LNA GAPDH引物的位置: GAP-2, GAP-2/3。原位探针:绿色为内含子,红色为外显子。B. sqRT-PCR检测来自2天的去分化肌小管的细胞质、细胞核、核质或染色体片段中的pCharme和mCharme的表达。片段的质量用GAPDH和pre-GAPDH(前体RNAs)检测. C. MHC蛋白(绿色)和Charme RNA(红色)在全分化的肌小管共染。D. sqRT-PCR检测Charme在生长和分化条件下的表达情况。E. qRT-PCR检测GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr处理的分化的肌小管中的mCharme和pCharme、MCK、MHC的表达。F. GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr处理的C2C12细胞中MHC进行免疫荧光染色。G. 定量GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr处理的细胞中肌小管的形成。


2. Charme通过与nctc域相互作用调节肌形成

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图2

A.RNA-seq分析Charme敲减后,转录本的改变。B. Charme敲减后,对上调或下调基因的GO富集分析。C. Charme敲减后,下调基因的KEGG富集分析。D. ChRIP实验:富集的RNA(左图)、富集的DNA(右图)。E. 2天的分化肌小管中,对Charme RNA 和nctc进行RNA/DNA FISH(左图)或lnc-31位点(右图)。(I)表示二维图片,(II)表示三维图片,(III)表示Z轴旋转。黄色箭头代表重叠信号。F. 在GAP-scr- 和GAP-2-转染的肌小管(2天分化)中,qRT-PCR检测Charme和Charme靶基因的表达。G. 在GAP-scr- 和GAP-2-转染的肌小管中,ChIP实验检测RNA Pol II(左)和H3K9ac(右图)。在GAP-scr- 和GAP-2转染的条件下,qPCR检测回复的染色体和基因间的表达。


3. Charme与nctc域物理性靠近

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图3

A.在肌小管生长和分化(DM1)条件下,Charme和nctc(上方)的双链DNA和lnc-31位点(下方)的FISH实验。B. GAP-scr- 和GAP-2-转染的肌小管(DM1)中,Charme和nctc位点进行DNA/DNA FISH实验。

 

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图4. Charme-/-小鼠的产生和展示的骨骼肌表型

A.上图: Charme位点和sgRNA1 and sgRNA2位置示意图;下图:单链ODN包含的2个同源性臂(灰线)100-nt-长的poly(A)/2×MAZ。B. qRT-PCR检测来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌匀浆中mCharme和pCharme的表达。C. 免疫荧光对来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌组织中肌营养不良蛋白进行染色。D. qRT-PCR检测来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌中MHC和MCK转录本的表达。E. qRT-PCR检测来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌中Tnnt3、Tnni2和Igf2转录本的表达。
 

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图5. Charme-/-小鼠展示出心脏表型

A.qRT-PCR检测来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心脏匀浆中mCharme和pCharme的表达。B. 对1个月大Charme+/+小鼠(左图)和Charme-/-小鼠(右图)的心肌进行苏木精和尹红染色。C. 免疫荧光对来自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中心脏组织中肌营养不良蛋白进行染色。D. qRT-PCR检测来自1个月的Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心脏匀浆中Myh7、Tnnt2和Igf2转录本的表达。E. 1天大的Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心脏组织中Charme和nctc位点的DNA/DNA FISH实验。


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6.Charme的特点与功能

A.带有PCR引物(hs-2, hs-3)和LNA GAPmers (hs-GAP-int1, hs-GAP-ex2)的人Charme基因组位点。B. 在增殖(GM)和鉴别(3、6、10)条件下的健康和营养不良(DMD)源发性肌细胞中RT-PCR检测人hs-pCharme(上图)和hs-mCharme(下图)的表达。C. aqRT-PCR检测分化的肌小管中细胞质和细胞核中RNA片段中hs-pCharme和hs-mCharme的表达。D. PCR扩增分析hs-pCharme内含子1,对oligos的位置进行了描述。E. qRT-PCR检测用hs-GAP-int1、hs-GAP-ex2或hs-GAPscr GAPmers处理分化5天的原代细胞中hs-mCharme、hs-pCharme、MCK、MHC、Igf2、Tnnt3、Tnni2、和Dmd mRNAs水平的表达。F. pCharme行为模式图:在增生的成肌细胞中,Charme没有被表达,它的染色质位点在空间上与nctc区域相距遥远;在分化的肌小管中,pCharme稳定在两个位置的物理距离允许它们共同调控的表达式。