CircRNA在疾病模型中的研究思路与高分攻略
栏目:最新研究动态 发布时间:2018-10-09
随着第二代测序技术的发展,small RNA(包括miRNA,ncRNA,siRNA,piRNA, tRFRNA)在疾病中的研究如雨后春笋般展开......

随着第二代测序技术的发展,small RNA(包括miRNA,ncRNA,siRNA,,piRNA, tRFRNA)在疾病中的研究如雨后春笋般展开,环状RNA相比于线性化的RNA而言circRNA表现出了非同一般的稳定性,circRNA较多的作为miRNA的海绵体(sponge)而存在,且在疾病的发生发展中发挥重要的作用。如何研究在这样的形势下保持严谨与不落俗套,建立好的疾病模型与选择好的实验思路尤为重要,2018年5月,上海第九人民医院矫形外科的研究人员在Ann Rheum Dis (IF=12.35)上发表了一篇名为 “Circular RNA VMA21 protects against intervertebral disc degeneration through targeting miR-200c and X linked inhibitor-of-apoptosis protein”的文章。为我们在疾病模型中研究circRNA提供了很好的思路借鉴。

本文的实验设计思路如下: miRNA差异表达→预测靶基因 mRNA→由ceRNA机制引出 circRNA→细胞模型&大鼠模型证明→疾病IVDD


机制图

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结果

1. miR-200c在退行性髓核组织(NP)中上调,参与调节髓核细胞的生存能力和功能

利用数据库GSE45856获得的微阵列数据,对退行性的髓核组织中miRNA的差异表达进行了研究。miRNA芯片检测到的2672个miRNA中,有14个miRNA在退行性髓核组织中上调 (图1A)。选择这些候选miRNA, qRT-PCR分析验证。miR-200c、miR-130b-5p和mir -2355 -5p在退行性NP组织中显著上调,其中miR-200c的上调水平最高(图1B)。这些miRNA在腰椎间盘退变(IVDD)大鼠模型中的表达模式与患者样本一致(图1C)。Northern blot也证实了退行性NP组织中miR-200c水平的升高(图1D)。miR -200c过表达细胞(图1E)显示凋亡细胞百分比增加(图1F), caspase活化升高,MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5表达增加,胶原蛋白II和aggrecan表达减少(图1G)。这些结果提示miR-200c在髓核细胞中的促凋亡和促代谢效应。值得注意的是作者选择了NP细胞(髓核细胞),一种在腰间盘最丰富的细胞类型,而且分泌多种细胞外基质+细胞因子,调控腰间盘的微环境。

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2. miR-200c通过抑制其靶点XIAP调控NPC的生存能力和功能

生物信息学预测凋亡通路调控因子XIAP是miR-200c的潜在靶点(图2A)。退行性NP组织中上调的miRNA与凋亡信号通路调控的相关性。野生型XIAP报告基因的荧光素酶信号被miR-200c抑制,而引入突变则消除了miR-200c的抑制作用(图2B)。与对照组相比,退行性NP组织中XIAP表达减少(图2C)。miR-200c的升高降低了XIAP的表达,而内源性miR-200c的降低增加了NPC中XIAP的表达(图2D)。TNF-αXIAP和IL-1β治疗诱导了在髓核细胞的XIAP蛋白质的减少,而mir - 200 c拮抗剂消除了这种减弱作用(图2 E)。我们进一步研究了miR-200c和XIAP在npc中的功能是否相关。此外, 接受TNF-α和IL-1β治疗时,XIAP的缺失明显中和了mir - 200 c拮抗剂在髓核细胞中的拮抗剂作用 (图2 F,G),表明mir - 200 c通过XIAP发挥其功能。

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3. CCircVMA21充当了miR-200c的海绵

starBase预测miR-200c具有多个环状RNA的结合位点。我们根据前20名的预测环状RNA评分进行筛选。通过qRT-PCR分析,circVMA21在NP组织中得到验证(图3A)。退行性NP组织中CircVMA21水平明显降低(图3B)。 FISH也证实了这一结果(图3C)。使用RNAhybrid对circVMA21与miR-200c的序列进行了比较,发现circVMA21含有6个miR-200c的假定靶点(图3D,)。其中5个位点通过荧光素酶检测得到验证(图3E)。相对于mRNA(图3F),该环状RNA丰富且耐RNAse R处理。North blot分析显示线性VMA21是通过线性探针检测的,而不是在剪接位点的圆形探针检测(图3G)。pull down试验显示,与引入破坏miR-200c与circVMA21结合位点的miR-200c突变相比,miR-200c富集了circVMA21(图3H)。CircVMA21来源于VMA21基因的最后一个外显子,主要转录mRNA的3’UTR。我们发现它拥有69个AGO2蛋白结合位点。交联和免疫沉淀(CLIP)序列显示至少30个AGO2结合区域位于VMA21 mRNA的3'UTR。其中5个区域与miR-200c的结合位点重叠(图3I)。AGO2免疫共沉淀发现内源性AGO2下调的circVMA21在转染miR-200c的NPCs中富集,但未富集其突变体(图3I),提示miR-200c促进了AGO2与circVMA21之间的联系。North blot分析显示circVMA21可以反向拉低miR-200c(图3J)。结果表明circVMA21能够直接与髓核细胞中中的miR-200c结合。

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4. circVMA21通过靶向miR-200c和XIAP在髓核细胞中发挥作用

腺病毒circVMA21感染导致NPCs中circVMA21过表达,siRNA抑制circVMA21表达(图4A)。North blot分析证实了外源性circVMA21摄入后circVMA21的数量增加(图4B)。circVMA21的上调增加了XIAP的表达,而circVMA21的下调导致了XIAP表达的降低(图4C)。circVMA21上调抑制了miR-200c对XIAP表达(图4D)和活性(图4E)的抑制作用。综上所述,这些结果表明circVMA21作为miR-200c的功能性海绵来调节XIAP的表达和活性。在炎性细胞因子治疗后,qRT-PCR分析发现NPCs中circVMA21水平降低,miR-200c水平升高,均可通过上调circVMA21逆转(图4F,G)。因此,circVMA21的强制表达抑制了这些细胞因子的凋亡和分解代谢作用,促进了胶原蛋白II和aggrecan的表达(图4H)。

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5. 在大鼠模型中,椎间盘内注射circVMA21可以缓解IVDD

通过穿刺成功建立了IVDD大鼠模型(图5A)。在穿刺1周和5周后,腺病毒人circVMA21使用33针细针注射入穿刺的IVD中。在第1、5和9周的x光检查显示,所有IVD穿刺组的椎间盘间隙随时间逐渐缩小。注射后各时间点,circVMA21组与未注射组、circVMA21-mut组椎间盘高度指数百分比(%)无显著差异(图5B、C)。注射9周后,circVMA21组IVDs MRI退变评分明显低于未注射组(图5D、E)。在体内RNA FISH发现circVMA21位于NP区域(图5F)。注射腺病毒circVMA21后,退行性NP组织中的circVMA21水平显著升高,miR-200c水平下降(图5G,H)。腺病毒circVMA21的注射缓解了NP的退行性变化,增强了细胞凋亡和分解代谢反应,降低了IVDD大鼠模型中ECM的组成(图5I,J,K,)。9周时,非注射组的组织学评分明显高于circVMA21组(图5L,M)。综上所述,这些结果揭示了升高的circVMA21水平对抑制鼻咽癌凋亡、抑制ECM分解代谢、促进NP内合成代谢以及在体内缓解IVDD的积极作用。

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