circPRMT5通过吸附miR-30c诱导EMT，促进膀胱癌的转移

Circular RNAs (circRNAs)是一类新的，在人类癌症中备受关注。但是其在癌细胞上皮间质转化（EMT）的角色仍不清楚。本成果于2018年10月12日发表杂志Clin. Cancer Res（IF=10.2），在本研究中，作者的目的想识别新的circRNAs调节膀胱癌（UCB）细胞的EMT，探究他们的调节机制。首先UCB组织VS邻近正常组织，做了circRNA芯片，筛选出了上调的circPRMT5。然后探究circPRMT5的功能和EMT机制。circPRMT5作为miRNA海绵体能够吸附miR-30c，调节SNAIL1/E-cadherin通路，进一步调节UCB细胞的恶性和EMT。并且作者进一步识别了circPRMT5在UCB病人的血浆和尿液外泌体中也是上调的，并且与肿瘤转移有相关性。circPRMT5可以考虑作为UCB病人的预后biomarker和治疗靶点。

技术路线

结果
1. CircRNAs在UCB组织中的表达谱和circPRMT5的特征。

图1. CircPRMT5在UCBs中上调并与患者的不良预后相关

A, UBC组织 VS 邻近的膀胱组织中，火山图展示了circRNAs 的表达改变倍数，红色代表显著改变的circRNAs。B, 聚类图展示，UBC组织 VS 邻近的膀胱组织中，差异表达的circRNAs。C, 散点图表示，UBC组织 VS 邻近的膀胱组织中，circPRMT5的表达。D, 低 VS 高表达circPRMT5的病人进行Kaplan-Meier曲线分析。E, 发散的和收敛的引物和F, Northern blots分析验证circPRMT5是circRNA。G, 核质分离PCR 和H, FISH实验验证circPRMT5主要定位在细胞质中。

2. CircPRMT5 促进UCB 细胞的恶性发展。

图2. 沉默circPRMT5 能够抑制UCB细胞的侵袭

A, 2个shRNA和示意图和下调效果。B, circPRMT5过表达的效果。C和D，Wound healing assay展示下调circPRMT5能够抑制UCB细胞的迁移，上调circPRMT5能够促进UCB细胞的迁移。E和F, Transwell assay下调circPRMT5能够抑制UCB细胞的侵袭，上调circPRMT5能够促进UCB细胞的侵袭。G和H,裸鼠成瘤实验展示下调circPRMT5能够抑制肺转移结节的数量或上调circPRMT5能够促进肺转移结节的数量。

3. CircPRMT5诱导UCB细胞的EMT。

图3. CircPRMT5激活SNAIL1通路诱导UCB细胞的EMT

A和B, Western blots 展示下调circPRMT5或上调circPRMT5后，EMT相关的marker表达情况。E-cadherin, Vimentin, N-cadherin, SNAIL1，PRMT5。C and D, 免疫荧光展示下调circPRMT5或上调circPRMT5后，EMT相关的marker表达情况，E-cadherin, Vimentin and N-cadherin。

4. CircPRMT5 在UCBs细胞中吸附miRNAs。

图4. CircPRMT5在UCB细胞中吸附miR-30c

A, Ago2-RIP assay展示circPRM5显著被富集。B, Luciferase reporter assay展示转染shRNA后LUC-circPRMT5的活性。C, Luciferase reporter assay展示转染83 miRNA mimicsLUC-circPRMT5的活性，进一步识别与circPRMT5结合的miRNA。D, miRNAs 和circPRMT5结合位点示意图。E, Luciferase reporter assay 展示转染miRNA mimics后LUC-circPRMT5 or LUC-circPRMT5-mutant的活性。F和G, RNA pull down assay展示circPRMT5和 miR-30c和circPRMT5相结合。H, IF 展示circPRMT5和miR-30c能共定位在对照和过表达circPRMT5的细胞中。

5. CircPRMT5调节miR-30c/SANIL1/E-cadherin通路并促进UCB细胞的恶性和EMT。

图5. CircPRMT5封闭miR-30c的抑癌效应

A和C,下调circPRMT5抑制细胞迁移(A) 侵袭(C)，这种现象能够被加入miR-30c inhibitor后挽救。B and D, 上调circPRMT5促进细胞迁移 (B) 侵袭 (D)，这种现象能够被加入miR-30c mimics后挽救。E，下调circPRMT5抑制肺转移结节的数量，这种现象能够被加入miR-30c inhibitor后挽救。 (F)，上调circPRMT5促进肺转移结节的数量，这种现象能够被加入miR-30c mimic后挽救。G和H,下调circPRMT5抑制Vimentin, N-cadherin和SNAIL1/E-cadherin通路，这种现象能够被加入miR-30c inhibitor后挽救。I和J, 上调circPRMT5促进Vimentin, N-cadherin和SNAIL1/E-cadherin通路，这种现象能够被加入miR-30c mimic后挽救。

6. CircPRMT5通过外泌体被释放到UCB病人的血浆和尿液中并与肿瘤转移相关。

图6. CircPRMT5被miR-30c/SANIL1/E-cadherin通路调节在UCB病人中

A, CircPRMT5与miR-30c的表达呈负相关性。B, CircPRMT5与SNAIL1的表达呈正相关性。C, CircPRMT5与E-cadherin的表达呈负相关性。D, miR-30c的Kaplan-Meier curves分析。E, miR-30c在结节转移中的表达情况。F, miR-30c与SNAIL1的表达呈负相关性。G, SNAIL1和E-cadherin的表达呈负相关性。H, 本文的机制模型： circPRMT5吸附miR-30c调节SNAIL1/E-cadherin通路，促进UCB细胞EMT和转移。