有了RNA-protein 相互作用的研究方法，再也不愁高分的SCI文章了！
热门研究的非编码RNA，包含LncRNAs、snoRNAs和mRNA UTR，其许多功能是与RNA结合蛋白(RBPs)直接相互作用实现的。最近研究发现数百种新RBPs的RNA结合域尚不清楚，于是强调RNA蛋白复合物的复杂性和多样性，进而最新研究成果扩展了RNA-protein 相互作用的两大类方法：一类方法是以RNA为中心，研究与感兴趣的RNA结合的protein；另一类方法是以蛋白质为中心，研究与感兴趣的protein结合的RNAs。由于每种方法都有其优势和局限，选择最佳方法来处理生物学问题变得非常重要。(Review,Methods to study RNA-protein interactions,IF=28.464)
一、以RNA为中心的方法：发现与感兴趣的RNA结合的RBPs
1.以RNA为中心的方法示意图
以RNA为中心的方法又分体内方法和体外方法。
体外方法：
方法a（1）是用于pull down 实验的RNA 5 '或3 ' RNA生物素化。末端生物素化RNA与streptavidin beads（链霉亲和素珠）结合，然后加入细胞提取物孵育后洗涤。此方法不需要洗脱RNA，向beads加入SDS，煮沸，用于蛋白质组学分析。
方法a（2）是感兴趣的RNA加适体标签，例如，S1适体标签与streptavidin beads结合，生物素可以竞争性地结合streptavidin ，以洗脱标记有S1适体的RNA。已有文献报导，Cys4 核糖核酸内切酶可以结合Cys4 hairpin loop，用imidazole（咪唑）将核酸酶从发夹环上分离，释放结合RNA的RBPs。优缺点：降低了非特异性的结果。
方法a（3）标记Cy5染料的体外转录（IVT ）RNA杂交到约9400个重组人蛋白(Human ProtoArray)的蛋白芯片。通过荧光检测结合Cy5 RNA的蛋白质。优缺点：Human ProtoArray方法不需要细胞提取物，有助于发现RNA-protein 相互作用的一种研究方法。然而，这类方法限制于斑点蛋白的折叠结构和翻译后修饰以及浓度的改变。
体内方法：
甲醛是一种小的双功能交联剂，易渗透细胞并在2个单位内交联大分子，包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA复合物交联，这种交联是可逆的。UV light 交联是一种零距离交联且不可逆。与甲醛交联剂相比，UV light 不交联蛋白质-蛋白质相互作用，特异性强，但效率较低。
方法b（1）是通过蛋白-RNA交联进而鉴定体内的相互作用。具体内容是在变性条件下去除非共价相互作用来纯化RNA，生物素化寡核苷酸探针与感兴趣的RNA杂交， RNA和交联蛋白被纯化与鉴定。优缺点：效率低，细胞用量多。
方法b（2）RNA-蛋白质相互作用检测法简称RaPID (LN-HA-Bira)，BoxB RNA茎环侧面结合感兴趣RNA，在含有生物素的培养基培养细胞，BoxB位点结合融合蛋白（λ-N ），融合蛋白引起与感兴趣RNA结合的蛋白生物素化，最后用streptavidin beads捕获生物素化的蛋白质。
| 方法 | 应用 | 优点 | 缺点 |
| RNA生物素化 | SMN mRNA | RNA末端标记生物素,与链霉亲和素珠结合强 | 在体外，可能偏好细胞提取物中丰富的蛋白质 |
| S1适体 | ARE motif | 用生物素易洗脱RBP复合物从streptavidin beads | 在体外，可能偏好丰富的蛋白质 |
| Cys4 | Pre-miRNA | 用咪唑洗脱RBP复合物 | 在体外，可能偏好丰富的蛋白质 |
| 蛋白芯片 | TINCR, SNORD50 | 不需要细胞提取物；不需要MS | 在体外，仅与微阵列上的蛋白质直接相互作用 |
| RAP | Xist, FIRRE noncoding RNA | 体内；运用UV交联和长的寡核酸探针（120nt），特异性高 | 耗费细胞量大 |
| TRIP | p27 mRNA, CEP-1 mRNA | 体内；紫外交联特异性高。 | Poly(A)和生物素化ASO的捕获使效率降低 |
| PAIR | ANK mRNA | 体内；紫外交联特异性高。 | 肽核酸生产耗费成本和精力 |
| MS2-BioTRAP | IRES | 体内；紫外交联特异性高。 | 需要MS2与RNA的结合，RNA和标签蛋白的转染/感染，耗费细胞量大 |
| CHART | Xist, MALAT1, NEAT1 | 体内 | 需要RNase识别探针位置的；耗费细胞量大 |
| ChIRP | TERC, Xist | 体内，探针设计无需要特异性RNA | 短探针可能会拉下类似的片段序列；耗费细胞量大 |
| RaPID | ZIKV-宿主蛋白相互作用 3’端UTR Motifs | 体内；所需细胞数量少；直接标记蛋白质 | 需要BoxB与RNA连接；限制短序列；RNA和标签蛋白的转染/感染 |
二、以蛋白为中心的方法：发现与感兴趣的蛋白质结合的RNAs
1.蛋白质纯化的方法
紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(CLIP-seq)原理
基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生耦联，以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀之后，回收其中的RNA片段，经添加接头、RT-PCR等步骤，对这些分子进行高通量测序，再经生物信息学的分析和处理、总结，挖掘出其特定规律，在体内与众多 RNA 靶标的结合模式，并揭示其在一些重要生物学过程中的功能，是一项在全基因组水平揭示 RNA分子与RBP相互作用的革命性技术。能够确定RBP与RNA直接的相互作用和精确的结合位点。
CLIP-seq 的应用范围：
（1）绘制全基因组范围的RNA和RBP相互作用图谱，解析“Argonaute（Ago）—miRNA—mRNA”三者的相互作用；
（2）RBP与miRNA、lncRNA等非编码RNA的作用网络与功能的发现；
（3）与 RIP-seq 相比，可以鉴定RBP和RNA之间的直接相互作用，确定 RBP 与miRNA、lncRNA 等非编码 RNA 的精确结合位点。
上图展示了从免疫沉淀到PCR，该图显示CLIP-seq的一些重要步骤。例如：XL，UV交联；IP，免疫反应；磷酸酶，3’端去磷酸化；激酶，5’端磷酸化；RT，逆转录；L3，RNA或DNA 3’端适体连接；L5，5’端适体连接；PK提取，从硝基纤维素膜中提取蛋白酶K；Ppt/柱，乙醇沉淀或柱分离核酸；TBE、Tris-B酸盐-EDTA；SA、抗生物素蛋白。
2.不需要蛋白质纯化的方法
在不纯化RBP的情况下识别RBP的靶RNA的方法是相对较新的，目前主要是对RNA进行两种不同化学修饰。第一种是TRIBE，感兴趣的蛋白质融合到ADAR酶，在ADAR使附近的腺嘌呤脱氨后，通过测序鉴定脱氨碱基。第二种是RNA标记法，poly(U)多聚酶与感兴趣的RBP融合后，添加poly(U)尾到结合的RNA。RNA 3’末端序列识别poly(U)尾；在特定亚细胞区过氧化物酶标记RBP，用于识别结合的RNA，这种方法还没有被用来鉴定靶RNA。酶修饰RNA的方法是可行的，以后会发现更多的酶修饰RNA。
我们希望更多的技术在这一领域快速发展，多种差异的化学标记分离RBP对于RBP纯化组合调控和化学修饰组合研究，以此研究RBP-RNA相互作用的位置。