揭秘一种新的参与白血病调控的LncRNA

      LncRNAs是一类长度大于200 nt不编码蛋白质的核苷酸，已经被发现在多种人类疾病中均有异常表达，包括癌症。9号染色体和22号染色体相互易位产生嵌合的Bcr-Abl癌基因，该基因与几种血液病有关。然而，LncRNAs的异常表达与Bcr-Abl介导的白血病之间的相关性功能仍不清楚。
      今年，Xuefei Wang等人在Mol Cancer发表一篇 “Novel lncRNA-IUR suppresses Bcr-Abl-induced tumorigenesis through regulation of STAT5-CD71 pathway”的SCI文章，该研究旨在综合评价经伊马替尼 （Imatinib）处理的人K562白血病细胞中LncRNAs的表达情况。
技术路线：

一、鉴定伊马替尼处理白血病细胞后上调的lncRNAs

利用lncRNA cDNA芯片分析在K562细胞中表达的LncRNAs，图A表示伊马替尼处理或不处理组，差异表达的LncRNAs聚类分析，987个上调LncRNA，1479个下调LncRNA。图B表示伊马替尼处理后显著上调的一个LncRNA 家族(Imatinib -upregated LncRNA，简称为lncRNA-IUR)，该LncRNA 家族有多个转录本，人来源的有8个转录本，鼠来源的有5个转录本。图C表示qPCR证明在K562白血病细胞中伊马替尼处理组相对于对照组lncRNA-IUR表达上调，lncRNA-IUR-5，6，8的表达具有显著性差异。图D表示qPCR证明在v-Abl转化的小鼠NS2细胞株中伊马替尼处理组相对于对照组lncRNA-IUR表达上调，lncRNA-IUR-4，5，6，8观察到类似的的表达具有显著性差异，与图C结果一致。图E和F表示从蛋白水平与RNA水平，BCR-Abl阳性患者外周血淋巴细胞lncRNA-IUR的表达显著低于正常人外周血淋巴细胞。上述结果表明，在Abl转化的白血病细胞中lncRNA-IUR的表达受到抑制，然而伊马替尼可诱导lncRNA-IUR表达.
此外，通过软件预测和实验分析lncRNA-IUR的编码潜力.进一步运用the Open Reading Frame (ORF) Finder，发现lncRNA-IUR每个转录本的ORF总长度小于300 bp。在UniProtKB/ swissprot(Swissprot)数据库中也没有预测到lncRNA-IUR的匹配肽。此外，运用Coding Potential Calculator (CPC)软件评估lncRNA-IUR家族是否具备编码能力，图G表示每个转录本的CPC评分为负，表明lncRNA-IUR家族“非编码”。图I表示在体外翻译实验中，我们能够观察对照基因KU70的蛋白带(约70kD)，但未能检测lncRNA-IUR-5、6或8的任何蛋白条带。为了进一步证明lncRNA-IUR没有编码能力，通过RACE试验鉴定了一段全长的lncRNA-IUR-5(2342 nt)。
二、lncRNA-IUR影响abl转化细胞存活及体内肿瘤生长

我们研究了在异种移植小鼠模型中，为了证明lncRNA-IUR是否对细胞存活和肿瘤形成有影响，运用shRNAs生成了lncRNA-IUR (sh- IUR -5，-6和-8)的K 562细胞株或荧光素以及显示荧光的对照细胞，图A表示lncRNA-IUR (sh- IUR -5，-6和-8)的K 562细胞lncRNA-IUR的表达相对于对照组明显降低，表明敲减成功。图B表示Imatinib浓度越高，K562细胞的生存率降低，lncRNA-IUR抑制细胞生存。图C和D表示采用异种移植小鼠模型，每只小鼠皮下接种表达shlncRNA-IUR的K562细胞，敲减lncRNA-IUR-5，6，8基因显著促进肿瘤生长。在V-ABL-转化的NS2细胞系，并使用SH- IUR -M45678敲减小鼠lncRNA-IUR-5，图F表示在NS2细胞中，敲减shlncRNA-IUR促进了细胞的存活。此外，图G表示sh- IUR--m45678的NS2细胞所形成的肿瘤比对照组大得多。实时定量PCR也证实了sh- IUR--m45678组相对于对照组 INcRNA-IUR在肿瘤中的表达下调。这些结果表明，无论在K562细胞还是在异种移植小鼠模型中，敲减INcRNA-IUR促进Abl转化的白血病细胞的存活和肿瘤的生长。

与上述结果一致，只是一种运用敲减INcRNA-IUR的方法，一种运用过表达INcRNA-IUR的方法，在异种移植小鼠模型中，过表达INcRNA-IUR抑制Abl转化的白血病细胞的存活和肿瘤的生长。
三、在体内敲减鼠LncRNA-IUR促进ABL介导的骨髓细胞转化和白血病细胞的生长

 A、LncRNA-IUR- KD转基因小鼠及WT小鼠的照片。B、RT-PCR检测LncRNA-IUR- KD转基因及WT小鼠中肺、脾、肝、胸腺和骨髓器官LncRNA-IUR -M5的表达.C、WT和KD小鼠中Bcr-Abl转化BMC细胞的存活克隆数，KD小鼠的转化效率显著高于野生型小鼠。D、通过注射表达sh- IUR -m45678，sh-luc的GFP阳性NS2细胞来建立白血病移植小鼠模型，三组分别标记为SH-Iur-M45678组、SH-Luc组和阴性对照组。E、白血病移植后8天后，生物发光成像显示稳定表SH-Iur-M45678或SH-Luc的GFP阳性NS2细胞在WT小鼠体内分布。F、流式细胞实验检测小鼠白血病移植后第6与第9天外周血单个核细胞的变化。这些结果表示敲减鼠LncRNA-IUR促进体内ABL介导的骨髓细胞(BMC)转化和NS2细胞的生长。
四、转基因小鼠沉默LncRNA-Iur为Abl介导的白血病的发生发展提供了理想的微环境。

A、建立KD和WT小鼠白血病移植模型， LncRNA-Iur-KD与WT小鼠在辐射后通过尾部静脉注入GFP阳性NS2细胞或等体积的PBS，实验组标记为NS2KD和NS2WT，对照组为PBS-KD和PBS-WT。 B、显示NS2-KD和NS2-WT小鼠在体内白血病移植后的第8天的代表性照片。C和D分别表示有缺陷的老鼠的体重(C)和存活率(D)，每组小鼠8-10只。对小鼠进行为期15天的监测。E、生物发光成像实验观察GFP阳性NS2细胞在小鼠体内的分布情况.F、流式细胞实验检测小鼠外周血单个核细胞中GFP阳性NS2细胞的百分率。三个独立实验，选择代表性的图像。G、HE染色小鼠脾脏。
五、LncRNA-IUR-5负调节STAT5介导的CD71表达

A、LncRNA-IUR-5敲除k562细胞系和对照细胞的转录组RNA测序分析。箭头表示CD71蛋白的三种亚型。B、 Western blot分析LncRNA-IUR-5基因敲除或过表达K562细胞株CD71 蛋白的表达水平。C-E 、Westernblotting证明分别用伊马替尼(C)、STAT5-In-1(50μM，6h)（D）或sh-STAT 5(E)敲除STAT 5来处理细胞，CD71 、P-STAT 5与STAT 5蛋白的表达水平。F、Western blot和RT-PCR检测CD71 、P-STAT 5与STAT 5蛋白和LncRNA-IUR-5的表达水平。G、从稳定表达LncRNA-IUR -S1、Iur-5或Iur-5的K 562细胞株中提取与LncRNA-IUR-5结合的蛋白。H、通过RIP验证LncRNA-IUR-5与STAT5的相互作用。lncRNA-BGL3和gapdh2为阴性对照。I和J、qPCR检测在STAT5-IN-1处理后或敲减K562细胞中lncRNA-IUR的表达。