m6A又一高分文章新鲜出炉啦

近年来，关于m6A的研究也已逐渐成为一个热门项目。MiR-221/miR-222在多种癌症研究中均有着不同程度的影响。今年6月，Han J等人在杂志《molecular cancer》上发表了一篇题为“METTL3 promote tumor proliferation of bladder cancer by accelerating pri-miR221/222 maturation in m6A-dependent manner”的高分文章（IF=10.679），结合两大热门研究来探讨膀胱癌的发展，首次通过调节非编码核糖核酸的m6A修饰来影响肿瘤形成的综合，发现METTL3与膀胱癌患者预后不良有关，可以作为膀胱癌的新型预后和治疗靶点，为膀胱癌治疗提供新的见解。
 

膀胱癌（BCA）已成为美国第五大常见癌症，2018年估计有81,190例新病例。膀胱癌的发展是一个复杂的过程，由异常的遗传变化和表观遗传异常引起。表观遗传异常主要发生在DNA，RNA和组蛋白修饰的许多层面。在RNA水平中，m6A是最常见的甲基化修饰之一。我们都知道METTL3参与RNA生命周期的所有阶段。它通过调控关键癌基因或肿瘤抑制因子mRNAs中的m6A修饰来影响肿瘤的形成。在膀胱癌中，METTL3可通过AFF4/NF-κB/MYC信号网络以m6A依赖方式促进膀胱癌的进展。最近，还发现METTL3影响non-coding RNAs (包括miRNAs, lincRNAs和circRNAs)中的m6A修饰。然而，这一机制是否与METTL3诱导的肿瘤增殖有关尚未报道。
研究思路：

结果分析
一、METTL3在膀胱癌和膀胱癌中上调与膀胱癌患者的预后相关
与邻近组织相比，METTL3在膀胱癌组织中显着上调（图1a），结果与TCGA数据库（https://cancergenome.nih.gov）下载的具有详细临床信息的肿瘤样本的结果一致。METTL3的蛋白质水平与邻近的正常组织相比，膀胱癌组织也显着增加（图1b）。研究者发现METTL3在膀胱癌细胞系中上调，与正常细胞系SV-HUC相比，mRNA和蛋白水平都有上调（图1c，d）。膀胱癌组织中的IHC分析显示METTL3的表达与肿瘤组织学分级有关（表1）。组织学分级较高METTL3组的高表达。此外，Kaplan-Meier存活曲线分析显示，METTL3高表达的膀胱癌患者预后较差，生存时间较短，而METTL3表达较低（图1f）。

二、在体内和体外试验中，METTL3的敲减抑制了膀胱癌的增殖
两种膀胱癌细胞系T24和EJ用敲低慢病毒和对照慢病毒稳定转染。然后用qRT-PCR和蛋白质印迹确认METTL3的表达。CCK8测定显示METTL3敲低导致细胞增殖显着减少（图2a，b）。菌落形成试验也表明了这一点敲低METTL3降低了集落形成效率（图2c，d）。此外，流式细胞术分析显示，METTL3敲低细胞中G1的百分比增加，S期的百分比降低（图2e，f）。在异种移植模型中，注射METTL3（shMETTL3）细胞的肿瘤比注射对照细胞（shNC）的肿瘤生长更慢（图2g，h）。

三、在体内和体外试验中，METTL3的过度表达促进了膀胱癌的增殖
  CCK8测定表明METTL3的过表达显着促进细胞生长与oeNC组（图3a，b）。殖民地形成测定还显示，在METTL3过表达细胞中集落形成效率增加（图3c，d）。此外，流式细胞术分析显示，METTL3过表达细胞中G1期百分比降低，S期百分比增加（图3e，f）。此外，注射METTL3过表达（oeMETTL3）细胞的肿瘤比在皮下异种移植肿瘤模型中注射对照细胞（oeNC）的肿瘤生长更快（图3g，h）。

四、METTL3与DGCR8蛋白互作，以m6A依赖性方式调节pri-miR221/222
m6A印迹显示METTL3敲低显着降低了m6A水平。相反，在T24和EJ细胞系中，METTL3过表达增加了m6A水平（图4a）。免疫沉淀实验表明METTL3可与DGCR8结合，RNase处理减弱了METTL3和DGCR8的结合，表明它们的结合可能部分由miRNA介导（图4b）。我们还观察到METTL3过表达细胞中DGCR8结合的miRNA显着增加（图4c），证实METTL3可能影响DGCR8与m6A甲基化miRNA的结合。所有这些结果都暗示着METTL3可通过调节DGCR8的识别和结合来影响pri-miRNA的加工膀胱癌中的pri-miRNA。
研究发现只有miR221/222，miR225，miR4485和let-7e在METTL3敲低后在T24中被改变。经研究预测在膀胱癌中的预后数据库（http://kmplot.com/analysis/）只有miR221/222在膀胱癌中发挥了致癌作用。然后通过调节miRNA221/222在膀胱癌中的表达，发现miR221/222在METTL3敲低细胞中显着下降并在METTL3过表达细胞中上调（图4d），pri-miR221/222的累积发生在METTL3敲低细胞中并且在METTL3过表达细胞中降低（图4e）。相关性分析显示56个肿瘤组织中METTL3和miR221（r = 0.2928，P <0.01）或miR222（r = 0.2386，P <0.01）的表达呈正相关（图4f）。此外，研究者发现通过从METTL3过表达细胞免疫沉淀的DGCR8增加了pri-miR221/222结合水平（图4g）。此外，MeRIP显示METTL3过表达显着增加m6A修饰的pri-miR221/222的量（图4h）。总之，这些结果表明METTL3可以增强DGCR8对pri-miR221/222的识别以及随后以m6A方式处理成熟miRNA。

五、miR221/222干扰挽救了扩散METTL3诱导膀胱癌细胞凋亡
当我们在METTL3敲低细胞中转染miR221/222 mimics时，研究者发现miR221/222 mimics可部分增加由METTL3敲低抑制的膀胱癌细胞增殖（图5a）。因此，miR221/222抑制剂可部分降低METTL3过表达诱导的细胞增殖（图5b）。集落形成实验也表明miR221/222 mimics可部分增加膀胱癌细胞。通过敲低METTL3抑制集落形成效率（图5c，d）。

六、miR221/222靶向PTEN治疗膀胱癌
通过mirtarbase数据库（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）发现在PTEN mRNA的3'-UTR中存在miR221/222的结合位点。（图6a）。此外，进行双荧光素酶报告基因测定克隆野生型3'-UTR序列和PTEN的突变体3'-UTR序列以构建报告质粒和突变载体，发现miR221/222mimics和野生型报告基因质粒的共转染显着降低了荧光素酶活性。相反，miR221/222共转染的mimics和突变质粒之间的荧光素酶活性没有显着差异（图6b）。通过qRT-PCR和蛋白质印迹验证了PTEN在METTL3敲低或过表达膀胱癌细胞中的表达，结果显示METTL3敲低细胞中PTEN的表达显着增加，METTL3过表达中PTEN的表达降低（图6c，d）。此外，PTEN的表达miR221/222 mimics转染后减少（图6e）并且在miR221/222抑制剂转染后增加进入膀胱癌细胞（图6f）。
通过突变PTEN的3'-UTR区的结合位点进行荧光素酶报告基因测定和m6A RNA免疫沉淀测定，结果显示在膀胱癌细胞中野生型和突变质粒之间的荧光素酶活性没有显着差异。 MeRIP结果还显示m6A和IgG沉淀的PTEN没有显着差异。总之，这些结果表明METTL3可能不直接调节膀胱癌中的PTEN mRNA。

七、PTEN与膀胱癌组织中的METTL3表达呈负相关
通过qRT-PCR研究了患者组织中METTL3和PTEN的表达。结果显示PTEN表达与METTL3在膀胱癌中的表达呈负相关（图7a）。此外，注射METTL3（shMETTL3）的肿瘤中PTEN的mRNA水平显着高于注射对照（shNC）的肿瘤（图7b），而注射METTL3过表达细胞的肿瘤中PTEN的mRNA水平（oeMETTL3）显着低于注射对照细胞（oeNC）的那些（图7c）。在异种移植模型中观察到PTEN蛋白水平的相同变化（图7d，e）。皮下异种移植肿瘤的IHC显示MET17阳性率显着降低，并且METTL3敲低组中PTEN阳性率显着增加（图7f）。 METTL3过表达组具有相反的结果（图7g）。总之，研究者发现PTEN与膀胱癌组织中的METTL3表达呈负相关。

结论:
METTL3可能通过与微处理器蛋白DGCR8相互作用并以m6A依赖的方式积极调节pri-miR221/222过程，在膀胱癌中可能具有致癌作用。据我们所知，这是第一个通过调节非编码核糖核酸的m6A修饰来影响肿瘤形成的综合研究，这可能为膀胱癌治疗提供新的见解。