8分文章实例告诉你lncRNA在铁死亡和癌症中该怎么研究

LncRNAs功能众多，也是目前大家的研究热点。而铁死亡（ferroptosis）这一新研究内容正在悄悄兴起，或成为下一次基金申请中的热门内容之一。目前认为，铁死亡是细胞内脂质氧化物的代谢障碍，进而在铁离子的催化下异常代谢，产生大量脂质，破坏细胞内氧化还原平衡，攻击生物大分子，触发细胞的死亡。在铁死亡研究尚存在众多谜团的情况下，关于lncRNAs在铁死亡中的作用研究更是少之又少。下面便给大家分享其中的一篇关于肺癌的研究。

                                                                                                                         文章流程图
      在前文研究中，作者团队发现Lymphoid-Specific Helicase （LSH）能与WDR76相互作用并促进如GLUT1、SCD1和FADS2等一系列铁死亡相关基因的转录，进而抑制铁死亡过程和促进肺癌的发生。在本文中，作者首先提出在LSH调节铁死亡过程中是否存在lncRNA参与这一问题。作者在LSH过表达后RNA-seq结果中发现了22个差异表达的lncRNA并在H358细胞中通过qPCR验证了测序结果，之后将研究目标锁定在表达量上升最高的LINC00336上。与之相对的，敲低LSH之后LINC00336的表达也显著下降。在肺癌临床样品中，LINC00336表达量也显著高于正常组织。结果如图1所示。

                                                                                                         图1 LINC00336表达受LSH调节并且与肺癌预后相关
      接下来作者检测了LINC00336调控肺癌细胞的各种表型。LINC00336过表达之后，肺癌细胞的增殖、克隆形成和成瘤能力都显著上升，而铁死亡水平显著降低。不同作用机制的铁死亡激活剂erastin和RSL3处理后，过表达LINC00336都能显著上调细胞存活。作者检测了总铁含量、二价铁离子含量、膜脂活性氧自由基、线粒体超氧化物和线粒体膜电位一系列铁死亡标志表型验证了这一结果。结果如图2所示。敲低LINC00336之后的结果相反，如图3所示。

                                                                                                 图2、图3 LINC00336促进肺癌细胞增殖、克隆形成和成瘤能力并抑制铁死亡
 

                                                                                                                      图4 LINC00336与ELAVL1存在相互作用
       LINC00336如何发挥调控铁死亡的功能呢？作者首先检测发现LINC00336定位于细胞核中。于是进一步通过RNA pulldown分析检测了与LINC00336相互作用的蛋白质。通过反义RNA对照和两种细胞H358和PC9的重复，作者发现并验证了ELAV-like RNA-binding protein 1 (ELAVL1)与LINC00336的相互作用。使用ELAVL1抗体进行RIP实验也有同样的结果。ELAVL1具有结合RNA并使其更稳定的功能，它识别无m⁶A甲基化的RNA并且结合基序为poly-U或AU-rich。在进行结构预测和结构域分析之后，作者对LINC00336和ELAVL1进行了一系列的截短检测，最后得出结论：ELAVL1的101-213氨基酸和LINC00336的1901-2107核苷酸相互作用。结果如图4所示。

                                                                                                                            图5 ELAVL1促进LINC00336的稳定
       在过表达ELAVL1之后，LINC00336 RNA水平上升，敲低结果相反。放线菌D处理后，过表达ELAVL1使LINC00336降解更慢；敲低结果则相反。结合上述结果，这证明了ELAVL1结合并稳定LINC00336。此外，作者也发现ELAVL1也在LSH过表达后表达量上调。P53也被报道在铁死亡中发挥着调控作用。一般认为，野生型P53正向调节铁死亡。该作者在之前的研究中也发现了LSH-lncRNA P53RRA-P53之间的调节作用。因此，作者也检测了P53在这个过程中的调节作用。结果如图5所示。

                                                                                                           图6 LINC00336结合MIR6852进而调控CBS mRNA水平
      LncRNA发挥功能的方式很多。可以通过形成特殊结构结合特定的转录因子并激活或者抑制其转录活性；可以通过其特异碱基序列引导转录因子激活特定基因的转录；可以直接影响基因转录调控区域的高级结构；可以直接也mRNA结合发挥激活或抑制功能；也可以结合miRNA发挥sponge作用。虽然作者检测了LINC00336这一细胞核lncRNA的相互作用蛋白，但只研究了对其有稳定作用的ELAVL1，对LINC00336在铁死亡中的功能仍未解释完全。于是，作者从sponge作用的角度对LINC00336进行了分析。在miRPathDB Microinspector分析结果中，作者发现了MIR6852能直接结合LINC00336和cystathionine-β-synthase(CBS)；而CBS是铁死亡过程中硫转运通路活性的标志蛋白。CBS的高表达降低细胞内的铁死亡水平。进一步的过表达、敲低和双荧光素报告基因系统的研究证明了LINC00336通过ceRNA机制吸附MIR6852从而促进CBS的表达。结果如图6所示。
      本篇文章lncRNA研究思路经典，铁死亡相关检测也具有系统性，值得大家参考学习。此外小编仍对LSH过表达后ELAVL1启动子区域P53结合下降但其mRNA水平升高以及LINC00336相互作用蛋白中是否有其他的转录因子或转录调控蛋白充满疑问。欢迎大家解答。