新看点来啦！转录因子six2促进竞争性内源RNA网络维持乳腺癌细胞的干性

已有文献报道CYP4Z1和假基因CYP4Z2P的表达在乳腺癌中特异性升高。作者此前也已经发现由这些基因介导的竞争性内源RNA（ceRNA）网络（ceRNET_CC）在乳腺癌血管生成，细胞凋亡和他莫昔芬抗性中的作用。 但是，ceRNET_CC在调节乳腺癌细胞干性中的作用以及调节ceRNET_CC的机制仍不清楚。这篇文章作者着重解决了这个问题，并于今年9月发表在影响因子8.731的J. Hematol. Oncol杂志上。

结果如下：
一、在体外CeRNET_CC促进乳腺癌细胞的干性
如图1A, B所示，CYP4Z1和假基因CYP4Z2P在乳腺肿瘤组织中的表达显著增加。生曲线表明CYP4Z1表达与乳腺癌患者OS呈负相关(图1C)。对CYP4Z1-3'UTR或CYP4Z2P-3'UTR过表达的MCF-7细胞进行表达谱分析，结果表明MCF-7细胞中由CYP4Z1-3'UTR和CYP4Z2P-3'UTR调节的基因之间高度重叠（图1D）。另外，CYP4Z1-3'UTR和CYP4Z2P-3'UTR激活（3854对3788）或抑制（3404对3934）MCF-7细胞中相似数量的基因（图1E，F）。该数据集的进一步基因集富集分析（GSEA）显示，在具有CYP4Z2P-3'UTR过表达的MCF-7细胞中观察到干细胞分化的特征的负富集（图1G），与CYP4Z1-3'UTR过表达相关的阳性信号最多的是胚胎干细胞功能和成体组织干细胞模块（图1H，I）。功能注释分析显示CYP4Z2P-3'UTR或CYP4Z1-3'UTR的过表达激活了调节干细胞多能性的信号传导途径（图1J）。在差异表达的基因中，在CYF4Z2P-3'UTR和CYP4Z1-3'UTR过表达的MCF-7细胞中鉴定了一组与上皮癌干细胞相关的基因特征，包括YY1，KRAS，YAP1和HMGB2（图1K）。与干细胞功能的激活一致，检测到一组细胞周期增加的相关基因，即CDK5R1，CDK1，CDK2和CDK7（图1）。CYP4Z1和CYP4Z2P的表达在临床乳腺癌样品中显示出正相关（图1L）。

                                     图1在体外CeRNET_CC促进乳腺癌细胞的干性

二、在体内ceRNET_CC促进乳腺癌细胞的肿瘤启动潜能
尽管所有细胞系都能以1×10⁶和1×10⁵细胞的密度形成肿瘤，但CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR过表达的细胞显示肿瘤大小和重量增加（图2a-d），敲低 CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR降低MCF-7细胞的肿瘤起始能力（图2a-f）。CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR的敲低显着降低了MDA-MB-231细胞的肿瘤起始电位（图2g-k）。 因此，我们的结果表明ceRNET_CC可以促进乳腺癌细胞的干性。

                                     图2在体内ceRNET_CC促进乳腺癌细胞的肿瘤启动潜能

三、ceRNET_CC通过hTERT/PI3K/Akt和ERK1/2通路促进乳腺癌细胞的干性
在CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR过表达后，癌症中的磷脂酰肌醇信号传导系统和MAPK信号传导途径是最高度上调的途径（图3a，b）。如图3c，d所示，由CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR过表达诱导的细胞球体形成增加或CD44 + / CD24-群体通过sihTERT转染或通过LY-294002或VX-11e处理而减弱。sihTERT，LY-294002或VX-11e处理减弱了由CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR过表达诱导的干性标志物的表达增加（图3e，f），敲低hTERT或 LY-294002和VX-11e治疗处理降低了p-Akt和p-ERK1 / 2水平。 以上结果证明ceRNET_CC以依赖于hTERT / PI3K / Akt和ERK1 / 2途径的方式促进乳腺癌细胞的干性。

                                  图3 ceRNET_CC通过hTERT/PI3K/Akt和ERK1/2通路促进乳腺癌细胞的干性

四、转录因子six2通过直接调节CYP4Z1和假基因CYP4Z2P的转录诱导ceRNET_CC的进展
峰和基序分析显示5'-TCAG-3'基序高度富集（P = 1e-11）（图4d），并且六个峰中的大多数位于启动子/转录起始位点（图4e）。six2占据了CYP4Z1和CYP4Z2P的启动子（图4f）。对具有或不具有six2过表达的MCF-7细胞进行ChIP测定。结果表明，six2确实与CYP4Z1和CYP4Z2P的启动子结合，并且six2过表达增加启动子的结合（图4g和h）。在乳腺癌组织中，six2和CYP4Z1表达与six2和CYP4Z2P表达呈正相关（图4i，j）。 这些结果表明six2直接结合CYP4Z1和CYP4Z2P的启动子，从而增加它们的表达并激活ceRNET_CC。

                                  图4转录因子six2通过直接调节CYP4Z1和假基因CYP4Z2P的转录诱导ceRNET_CC的进展

五、转录因子six2促进乳腺癌细胞的干性
在MCF-7细胞中观察到CYP4Z1-3'UTR -或CYP4Z2P-3'UTR和six2调控的基因表达谱之间存在很大的重叠和正相关（图5a和b）。GSEA显示，six2过表达导致与胚胎干细胞和乳腺干细胞功能相关的基因集富集(图5f, g)。所有细胞系都可以在1×10⁶和1×10⁵细胞密度下形成肿瘤，但是six2过表达的细胞显示出肿瘤大小和重量的增加，而six2敲低的细胞表现出肿瘤大小和重量的减少（图6a-d）。 此外，在six2过表达或敲低后用MDA-MB-231细胞进行体内致瘤性测定，并证明six2显着减弱了MDA-MB-231细胞的肿瘤起始电位（图6e-i）。 总之，功能获得和功能丧失测定表明，six2可以促进乳腺癌细胞的干性。

                                     图5转录因子six2在体外促进乳腺癌细胞的干性

                                      图6转录因子six2在体内促进乳腺癌细胞的干性

六、ceRNET_CC对于six2诱导的效应是充分必要的
如图7a-d所示，通过si-Z1和/或si-Z2P转染使由六氧化二过表达诱导的增加的细胞球体形成，CD44 + / CD24-群体和干性标志物表达无效。 CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR敲低降低了hTERT，p-Akt和p-ERK1 / 2水平，甚至逆转了6β介导的hTERT，p-Akt和p-ERK1 / 2水平的增加（图7e）。

                                       图7 CeRNET_CC对于six2诱导的效应是充分必要的

参考文献：
Zheng Lufeng., Guo Qianqian., Xiang Chenxi., Liu Shijia., Jiang Yuzhang., Gao Lanlan., Ni Haiwei., Wang Ting., Zhao Qiong., Liu Hai., Xing Yingying., Wang Yaohui., Li Xiaoman., Xi Tao., (2019). Transcriptional factor six2 promotes the competitive endogenous RNA network between CYP4Z1 and pseudogene CYP4Z2P responsible for maintaining the stemness of breast cancer cells., J Hematol Oncol, 12, 23.