circTRIM33-12作为MicroRNA-191的吸附海绵起到抑制肝细胞癌的作用

   肝细胞癌（HCC）是全球排名第三的死亡相关癌症，HCC的临床特征是其侵袭性，预后不良和治疗机会有限。近期, 复旦大学中山医院研究团队在Molecular Cancer期刊上发表了一题名为：Circular RNA circTRIM33–12 acts as the sponge of MicroRNA-191 to suppress hepatocellular carcinoma progression的文章。该文章主要讲述了circTRIM33-12可以作为致癌miR-191的吸附海绵起作用以上调TET1表达并因此抑制HCC进展。

一、在HCC中调节TRIM33衍生的circTRIM33-12
   TRIM33是一种肿瘤抑制基因，TRIM33在HCC中的下调是由TRIM33启动子中CpG岛的高度甲基化引起的，表明源自TRIM33的circRNA表达可能在HCC细胞中下调。作者通过qRT-PCR分析了四对HCC组织样品中18种TRIM33来源的circRNA。在四个HCC肿瘤组织中的circTRIM33-12（hsa_circRNA8662-12）表达显著降低。circTRIM33-12由TRIM33外显子12-18组装而成。为了进一步研究circTRIM33-12表达对HCC患者的预后意义，对200例HCC及癌旁组织进行qRT-PCR验证circTRIM33-12的表达。与癌旁组织相比，116例（58%）HCC组织中circTRIM33-12表达显著降低。以circTRIM33-12的表达中间值为节点，对HCC组织进行高表达与低表达划分。分析circTRIM33-12表达与HCC患者临床病理特征之间的关系，与高表达的患者相比，cirTRIM33-12 表达量低的 HCC患者肿瘤大小较大（P  = 0.022），肿瘤数量多（P  = 0.028），侵袭强（P  = 0.007）。对这200例患者进行术后生存和术后复发进行分析，发现cirTRIM33-12低表达患者生存期显著高于高表达患者，手术复发显著低于高表达患者。

二、circTRIM33-12抑制HCC细胞的增殖和侵袭
   从7种HCC细胞系中筛选circTRIM33-12低表达细胞系，选取SMMC-7721和HCCLM3进行后续试验。与对照组相比，过表达circTRIM33-12后SMMC-7721和HCCLM3细胞的生长和转移显着受到抑制。敲低circTRIM33-12促进了高表达细胞系Huh 7和MHCC97L细胞的生长和转移。为了进一步探索circTRIM33-12在体内的作用，将过表达的SMMC-7721和对照组种植到小鼠肝内。过表达的肿瘤体积和转移能力显著低于对照组。

三、circTRIM33-12可作为miR-191的吸附海绵
   Huh 7细胞中用针对AGO2的抗体进行RIP实验，circTRIM33-12对AGO2抗体有明显富集作用，表明可作为AGO2和miRNA的结合平台。使用数据库预测到11个可能与circTRIM33-12结合的潜在miRNA。这11种miRNA中有三种是癌基因，分别是miR-23a-3p，miR-191和miR-224-5p。为了进一步研究circTRIM33-12与这三种miRNA结合，构建含有荧光素酶基因的circTRIM33-12表达质粒载体，并将质粒载体转染到Huh 7细胞中。观察到转染后3种miRNA减少，特别的miR-191显著减少。使用生物素标记的miR-191进行pulldown实验，与NC组相比miR-191对circTRIM33-12有明显富集作用。对miR-191敲低过表达，发现circTRIM33-12表达没有变化；circTRIM33-12过表达后，miR-191表达也没有变化。这说明circTRIM33-12和miR-191可能不会相互降解。这些实验表明，circTRIM33-12可以作为miR-191的吸附海绵起作用。

四、circTRIM33-12通过海绵miR-191上调TET1表达
   一些研究显示，TET1，TIMP3，SATB1和DIECR1受miR-191影响。但是在炎症细胞系中上调或敲低miR-191对它们的mRNA和蛋白表达水平没有改变，但是对TET1蛋白表达有影响。使用荧光素酶报告法检测TET1 mRNA的3'UTR是否是HCC细胞中miR-191的靶标，结果表明miR-191和TET1 mRNA在HCC细胞中的直接相互作用。为了验证circTRIM33-12对TET1表达的影响，过表达circTRIM33-12，检测TET1 mRNA和蛋白质表达水平。结果表明，circTRIM33-12的过表达显著增加TET1蛋白水平而不是mRNA水平。circTRIM33-12的敲低显著降低TET1蛋白水平而不是mRNA水平。荧光素酶活性测定表明敲低circTRIM33-12后，TET1活性下降；circTRIM33-12与miR-191一起敲低后，TET1活性无影响。circTRIM33-12过表达后，TET1活性增强；circTRIM33-12过表达同时miR-191敲低后，TET1活性无影响。在200例HCC患者组织使用qRT-PCR和IHC验证TET1的表达。发现在HCC患者中circTRIM33-12和TET1之间呈正相关关系。

五、circTRIM33-12和TET1负责调节5hmC的表达
   在circTRIM33-12和TET1过表达的SMMC-7721和HCCLM3细胞中比较5mC和5hmC水平，发现在circTRIM33-12-或TET1-过表达细胞中5hmC的水平显着增加；相反，，在circTRIM33-12或TET1敲低的Huh 7和MHCC97L细胞中5hmC的水平显着降低。并且过表达TET1的细胞细胞增殖和侵袭迁移能力明显减弱。结果与第二部分完全结果一致，。这些数据证明了circTRIM33-12作为miR-191的吸附海绵抑制HCC进展，通过circTRIM33-12 / miR-191 / TET1轴抑制miR-191致癌作用。

六、TET1负调节癌基因表达并与免疫逃避有关
   接下来试图研究TET1敲低是否转录抑制HCC细胞中的肿瘤抑制基因表达。RNA-seq结果显示，TET1敲低下调了几种参与肿瘤进展的肿瘤抑制基因，如WWC家族成员3（WWC3），肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1（TP53INP1），UL16结合蛋白1（ULBP1）和赖氨酸脱甲基酶7A（JHDM1D）。为了研究circTRIM33-12是否通过miR-191 / TET1轴发挥其生物学功能，在circTRIM33-12和TET1敲低或过表达的HCC细胞中检测WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的表达。敲低circTRIM33-12或TET1显著减少了WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的表达。过表达circTRIM33-12或TET1增加WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA和蛋白表达水平。使用荧光素酶报告基因测定验证WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA的3'UTR是否是miR-191的靶标。结果发现荧光素酶活性无明显变化，这就说明WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA的3'UTR不是miR-191的靶标。为了进一步探讨circTRIM33-12与免疫逃避之间的关系，检测200例HCC癌和癌旁组织中NKG2D的表达。在HCC组织中NKG2D阳性细胞的数目与癌旁组织相比较显著降低。散点图分析揭示了在HCC组织中circTRIM33-12表达和NKG2D阳性细胞数之间呈正相关性。这些结果表明，circTRIM33-12可通过海绵吸附作用miR-191保护TET1而发挥其抗肿瘤作用。

七、miR-191的敲低改变了circTRIM33-12的敲低并诱导了HCC细胞的进展
   接下来探讨了miR-191的敲低是否影响了cirTRIM33-12敲低的HCC细胞增殖、迁移和侵袭。在敲低cirTRIM33-12的细胞系中，敲低miR-191 ，TET1蛋白表达升高，mRNA表达无变化。在敲低cirTRIM33-12的细胞系中，miR-191的敲低显著降低了HCC细胞增殖、迁移和侵袭。

结论：
   在HCC组织中circTRIM33-12表达显著降低，并且低水平的circTRIM33-12表达与HCC患者的不良预后相关。circTRIM33-12通过吸附miR-191并上调TET1表达抑制HCC增殖、转移和免疫逃避，表明其在HCC进展中的肿瘤抑制作用。为HCC靶向治疗提供了新的靶点。