缺氧胶质瘤细胞分泌的外泌体miR-301a的作用机制

    最近的证据表明，miRNAs可以被释放到细胞外微环境中，并通过外泌体介导细胞与细胞之间的通讯。今天小编带大家了解近期发表于Molecular therapy上的一篇关于缺氧胶质瘤细胞分泌的外泌体miR-301a通过靶向TCEAL7激活Wnt/β-catenin信号并促进放疗抵抗的文章。本研究的目的是鉴定参与胶质母细胞瘤（GBM）抗放疗的外泌体miR-301a（exo-miR-301a），并揭示其可能的机制。

技术路线：

结果：
1.exo-miR-301a由缺氧GBM细胞特异性表达和分泌
   根据我们之前的观察，miR-301a在胶质瘤组织中显著上调。在此，我们检测exo-miR-301a在缺氧人GBM中的功能。HIF-1α表达作为缺氧生物标志物，与miR-301a在胶质瘤患者中的表达进行比较。HIF-1α水平高的患者miR-301a表达水平较高（图1A），血清exo-miR-301a的百分比根据HIF-1α免疫组化评分分布（图1B）。ELISA结果显示，GBM细胞对缺氧的反应是通过增加细胞核中HIF-1α的水平（图1C）。从正常或缺氧条件下暴露的GBM细胞中检测含有CD9、CD63、CD81和HSP70的外泌体标记物。如图1D所示，缺氧细胞中所有外泌体标记物的水平均高于常氧细胞。低氧条件也显著增加了外泌体中存在的囊泡数量，这可以通过纳米颗粒跟踪分析检测到（图1E）。为了探讨miR-301a表达增加与HIF-1α之间的关系，我们观察了miR-301a和exo-miR-301a在HIF-1α不同状态下的水平。缺氧诱导HIF-1α, siRNA干扰后降低（图1F）。缺氧显著增加了miR-301a和exo-miR-301a的表达；同时，HIF-1α的下调显著降低了miR-301a和exo-miR-301a的表达（图1G和1H）。综上所述，我们证明exo-miR-301a是由缺氧GBM细胞特异性分泌的，与HIF-1α状态有关。

2.来自缺氧胶质瘤细胞的exo-miR-301a直接作用于常氧胶质瘤细胞中的TCEAL7
   为了探讨miR-301a在TCEAL7调控中的作用，我们检测了exo-miR-301a与TCEAL7蛋白在胶质瘤患者中的关系。TCEAL7水平与miR-301a的表达水平呈负相关（图2A）。为了证实miR-301a与TCEAL7的直接结合，设计荧光素酶报告实验，利用含有野生型(WT)和突变体(MT)的荧光素酶报告质粒TCEAL7 3’UTRs与miR-301a结合位点进行。TCEAL7 3‘UTR包含miR-301a的两个高度保守的靶位点，第一个靶位点被证明是结合位点（图2B）。如图2C所示，与TCEAL7- 3’UTR突变组相比，miR-301a在常氧和缺氧条件下均显著干扰了转染luc -TCEAL7-UTR的细胞的荧光素酶活性。与荧光素酶报告实验结果一致，在常氧和缺氧条件下，转染As-miR-301a导致TCEAL7表达显著下降（图2D）。此外，我们还检测了正常培养的GBM细胞中TCEAL7的表达。与对照组和常氧外泌体组相比，缺氧外泌体处理降低了荧光素酶活性（图2E）。此外，与正常组和对照组相比，缺氧外泌体处理显著改变了TCEAL7蛋白水平（图2F）。通过转染As-miR-301a，可以阻止缺氧衍生的外泌体对TCEAL7下调的影响（图2G）。

 

3.TCEAL7在胶质瘤恶性肿瘤中经常下调
   在相似的组织中检测到TCEAL7蛋白水平，并随着恶性肿瘤程度的增加而下调（图3A）。采用qPCR技术分析TCEAL7在胶质瘤及正常脑组织中的表达。如图3B所示，TCEAL7在胶质瘤组织中的表达低于正常组织，且随着病理分级的升高而降低。生存分析显示TCEAL7高表达患者的生存率明显高于TCEAL7低表达患者（图3 C）。与对照组相比，在TCEAL7载体组中TCEAL7蛋白水平显著升高（图3D）。 MTT结果显示，经TCEAL7处理的细胞存活率低于阴性对照组细胞（图3E）。克隆实验表明，转染TCEAL7载体的细胞在软琼脂上形成的菌落明显少于对照组（图3F）。此外，上调TCEAL7表达可显著降低GBM细胞侵袭能力（图3G）。采用Annexin V/propidium iodide（PI）双染色，TCEAL7载体中凋亡细胞比例显著增加（图3H）。接下来，我们建立了皮下肿瘤U87细胞株，如图3I所示，两组在肿瘤大小的前9天无明显差异；然而，从第10天开始，与对照组相比，TCEAL7载体组的异种移植瘤的大小明显减小。

4.TCEAL7通过与β-catenin结合负调控Wnt/β-catenin转录通路，而不抑制β-catenin的稳定性
   为了研究TCEAL7与Wnt/ β-catenin信号通路之间的相互作用，我们首先研究了TCEAL7过表达对H4细胞中β-catenin/T细胞因子（TCF）转录活性的影响。β-catenin的加入显著增强了TOP FLASH活性。然而，TCEAL7的过表达抑制了β-catenin刺激的TOP FLASH报告基因的活性（图4A）。另外，通过TOP/FOP reporter构建的高级别胶质瘤细胞U87和LN229中检测到，TCEAL7的高表达显著抑制了Wnt/β-catenin活性（图4B）。然后我们检测TCEAL7是否调控wnt靶向基因的表达。结果表明，在TCEAL7过表达细胞中，wnt靶向基因的表达水平显著降低（图4C）。但过表达TCEAL7并没有抑制β-catenin蛋白水平（图4D）。为了进一步研究TCEAL7过表达对β-catenin稳定性的影响，我们进行了环己酰亚胺追踪实验。结果显示过表达TCEAL7的细胞与对照细胞相比，β-catenin没有显著变化（图4E）。为了深入了解TCEAL7抑制表面TCF活性的机制，我们研究了TCEAL7是否与β-catenin发生物理作用。结果表明纯化后的TCEAL7与GST-β-catenin共沉淀，但不单独与GST共沉淀（图4F）。此外，HA-β-catenin与FLAG-TCEAL7共沉淀（图4G）。内源性β-catenin与内源性TCEAL7共沉淀，在U87和LN229细胞中形成复合物（图4H）。最后，当我们增加TCEAL7在胶质瘤细胞中的表达时，我们检测了β-catenin的核易位。免疫荧光图4I显示，与空白对照相比，TCEAL7过表达阻断了β-catenin从细胞质向细胞核的易位。

5.从缺氧胶质瘤细胞中提取的exo-miR-301a转移到正常胶质瘤细胞中，通过靶向TCEAL7增加Wnt/ β-catenin信号的活性
   为了证实缺氧胶质瘤细胞分泌的miR-301a可以通过外泌体转移到正常细胞中，我们测量了不同胶质瘤细胞经正常或缺氧处理后分泌的外泌体miR-301a水平。在源自受体缺氧细胞的外泌体中，成熟miR-301a的细胞水平升高（图5A），但未观察到pri-或pre-miR-301a在外泌体摄取方面的变化（图5B）。此外，经外泌体处理的细胞中miR-301a的水平没有受到RNA聚合酶II抑制剂的显著影响（图5C）。我们研究了Wnt/β-catenin的转录活性，以阐明TCEAL7参与exo-miR-301a介导的Wnt/β-catenin信号通路。图5D和图5E显示，miR-301a模拟转染和缺氧胶质瘤细胞源性外泌体暴露显著增加了Wnt/β-catenin信号的表达和转录活性。相反，高水平的TCEAL7降低了miR-301a模拟物或暴露于缺氧外泌体诱导的Wnt/β-catenin活性。同样，在缺氧细胞中抑制TCEAL7可以消除As-miR-301a在TOP-FOP检测中的作用。此外，As-miR-301a和TCEAL7载体挽救了缺氧细胞来源的外泌体对Wnt/β-catenin活性的影响（图5F）。

6.miR-301a参与缺氧外泌体共培养胶质瘤细胞的放射敏化
   为了探讨缺氧的exo-miR-301a水平是否介导胶质瘤细胞的放射敏化，我们检测了细胞辐照后的生存能力。结果表明，缺氧外泌体组与常氧细胞相比，在辐射诱导的存活率方面无明显下降，且表现出抗辐射能力。此外，miR-301a下调或TCEAL7升高显著增加细胞对辐射的敏感性（图6A）。此外，与常氧外泌体组相比，缺氧外泌体组在细胞活力方面不能被进一步抑制；然而，当转染As-miR-301a或TCEAL7载体时，情况发生了逆转（图6B）。我们进一步研究了miR-301a对辐照后细胞凋亡的影响。结果表明常氧外泌体培养组被4-或8-Gy照射诱导的凋亡细胞比例明显高于缺氧外泌体组，另外伴有As- miR -301a或TCEAL7载体时，凋亡能力得到恢复（图6C ）。为了便于体外实验，利用U87胶质瘤细胞系建立皮下肿瘤，进一步评估miR-301a在低氧胶质瘤耐辐射中的作用。在异种移植瘤生长试验中，与对照组相比，缺氧外泌体组中辐射不能显著降低肿瘤生长，体外检测分析显示，As-miR-301a或TCEAL7载体增强了肿瘤抑制作用（图6D）。然后进行qPCR检测受Wnt/β-catenin通路转录调控的mRNA水平。Wnt/β-catenin下游基因在缺氧外泌体条件下被激活；然而，As-miR-301a或TCEAL7可以显著抑制过表达（图6E）。

总结：
   exo-miR-301a是缺氧胶质瘤细胞特征性表达和分泌的，是Wnt/β-catenin的一个强有力的调节剂，然后通过靶向抑癌基因TCEAL7降低放疗敏感性。这可能为GBM患者的细胞耐肿瘤治疗放疗提供一个新的靶点。