CircFOXO3促进胶质母细胞瘤的进展

   环状RNA是一种新发现的内源性非编码RNA，被认为可以介导多种类型肿瘤的进展。越来越多的证据表明环状RNA在癌症中异常表达，并参与肿瘤的发展，包括增殖、存活和运动。另外环状RNA主要作为miRNA海绵，它们通过竞争性结合miRNA反应元件相互沟通和调节，进一步调节miRNA靶向基因表达，结合蛋白质，编码蛋白质和促进核易位。这些发现表明，异位表达的环状RNA在肿瘤发生和癌症进展中起重要作用。虽然已经对环状RNA在GBM中的作用进行了初步研究，但对环状rna在GBM中的临床意义和作用机制仍未明确。因此，小编通过以下这篇文章，让大家对circFOXO3在胶质母细胞瘤中的作用机制有深刻的了解。

   本研究中，首先，我们通过qRT-PCR分析了GBM和非癌组织中circFOXO3的变化。接下来，我们使用功能损失和功能获得的方法来评估circFOXO3对GBM细胞增殖和侵袭的影响。最后，我们进行了荧光原位杂交、RNA下拉、双荧光素酶报告基因和RNA免疫沉淀分析，以确认环状FOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p在GBM中的相互作用。并用动物模型验证了体外实验结果。
结果：
1.人GBM组织中CircFOXO3高表达
   CircFOXO3包含一个外显子，该外显子通过反向剪接最终产生一个1435个核苷酸的转录本（图1A，B）。使用扩增引物在GBM细胞中扩增出连接位点上游和下游约100 bp的CircFOXO3 cDNA，并通过Sanger测序进行分析。结果证实了circFOXO3连接（图1C）。扩增引物在有或无RNase R处理的cDNA中检测到环状RNA，证明circRNA是真正的环状（图1D）。
   为了研究circFOXO3在GBM中的表达是否变化，我们检测了48例胶质瘤和10例正常对照组中circFOXO3的表达。如图1E所示，高级别胶质瘤（HGG）的circFOXO3明显高于低级别胶质瘤（LGG）。总之，这些数据表明，circFOXO3表达的增加可能与GBM进展密切相关。接着我们测定了4个GBM细胞（U87-MG、U251-MG、A172和T98G）和人类正常胶质细胞（HEBs）中circFOXO3的表达水平。与HEBs相比，GBM细胞中circFOXO3明显上调，U251-MG和U87-MG高表达，A172和T98G低表达。因此，U251-MG和U87-MG用于circFOXO3 KD，A172和T98G用于circFOXO3 OE（图1F）。另外，我们有效地敲除了U87-MG和U251-MG细胞中的circFOXO3（图1G和1I）。我们还成功构建了circFOXO3表达慢病毒和过表达circFOXO3在A172和T98G中的表达（图1H，I）。这为接下来探索circFOXO3在GBM细胞中的作用奠定了基础。

2.CircFOXO3在体外促进GBM的发生和侵袭
   为了验证circFOXO3的功能，我们进行了细胞实验。CCK-8实验表明，circFOXO3 KD可以显著抑制U87-MG和U251-MG细胞的增殖（图2A，B）。此外，集落形成实验表明，circFOXO3 KD可以减少集落数量（图2C，E）和体积（图2F）。然后，我们使用transwell和伤口愈合试验来分析circFOXO3对GBM细胞侵袭的影响。Transwell实验表明，circFOXO3 KD细胞的侵袭力明显减弱（图2 G-I）。此外，伤口愈合实验表明，U87-MG和U251-MG的伤口闭合速度比对照组慢（图2J-L）。总的来说,这些发现为circFOXO3 KD在体外抑制GBM细胞的增殖和侵袭提供了证据，circFOXO3水平的升高对促进GBM细胞的肿瘤发生和侵袭具有重要作用。

3.CircFOXO3在GBM细胞中充当MiR-138-5p和MiR-432-5p的海绵
   环状RNA主要位于细胞质中，通常作为miRNA海绵来调控表达和活性。因此，我们首先搜索了circRNADb数据库，发现circFOXO3没有预测到任何蛋白特征。第二，FISH分析显示circFOXO3含量丰富，位于胞质中（图3A）。基于上述发现，我们探讨了circFOXO3是否与miRNAs结合。
   我们在不同的公共数据库（RegRNA、starBase、miRDB和CircInteractome）和以前的报告中筛选并分析了2种miRNA （miR-138-5p和miR-432-5p）。这些miRNA在胶质瘤中表达下调，且与circFOXO3相关的特异性miRNA有多个结合位点。在寻找与circFOXO3结合的miRNAs时，我们发现在circFOXO3中miR-138-5p/miR- 432-5p的结合位点（图3B）。随后，我们研究了circFOXO3与GBM细胞中miR-138-5p/ miR-432-5p的相关性。MiR-138-5p和miR-432-5p表达在circFOXO3 KD后上调，在circFOXO3 OE后下调（图3C，D）。此外，过表达miR-138-5p/miR-432-5p后，circFOXO3水平明显降低，抑制miR-138-5p/miR-432-5p后，circFOXO3水平升高（图3E，F）。
   为了验证circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p之间的直接结合，我们进行了生物素偶联miRNA捕获和荧光素酶活性测定。生物素标记的miR-138-5p/miR-432-5p及其突变模拟物被设计用于拉低过表达circFOXO3的T98G细胞中的circFOXO3。与突变体相比，我们发现野生型miR-138-5p/miR-432-5p中circFOXO3明显富集（图3G）。此外，HEK293T细胞共转染miR-138-5p/miR-432-5p模拟物和荧光素酶报告基因。与对照组相比，miR- 138-5p/miR-432-5p转染降低了荧光素酶报告基因的活性。然后，我们对miR-138-5p/miR-432-5p的预测结合位点进行突变，发现miR-138-5p/miR-432-5p模拟物和对照组的荧光素酶报告基因活性没有差异（图3H）。先前研究表明，环状RNA与miRNA的结合是由AGO2介导的。因此，我们在U87-MG中进行了anti-AGO2 RIP实验，结果显示circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p在AGO2中富集（图3I）。这些结果表明circFOXO3可以作为miR-138-5p/miR-432-5p的海绵。

4.MiR-138-5p/miR-432-5p通过靶向GBM细胞中的NFAT5而下调并作为抑癌基因
   考虑到circFOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p之间的相互作用，我们接下来评估了miR-138-5p/miR-432-5p在GBM中的表达和功能。如图4A和B所示，HGG中miR-138-5p/miR-432-5p明显低于正常对照组。此外，CCK-8实验显示，miR-138-5p/miR-432-5p表达降低可显著提高细胞活力（图4C，D）。此外，transwell实验表明，miR-138-5p/miR-432-5p抑制剂转染细胞的侵袭能力明显高于nc转染细胞（图4E）。
   根据既往报道，某些GBM致癌基因是miR-138-5p/miR-432-5p的靶标。因此，使用mirDIP数据库在miR-138-5p/miR-432-5p靶标中选择了14个致癌基因。在这些致癌基因中，有3个（CDK6、NFAT5和SP1）与肿瘤的进展密切相关。因此，我们改变了miR-138-5p/ miR-432-5p的表达，并检测了各自靶细胞的水平（图4F，G）。Western blot分析显示过表达miR-138-5p或miR-432-5p的细胞中NFAT5表达下调，而转染miR-138-5p或miR-432-5p抑制剂的细胞中NFAT5表达上调（图4 G）。此外，GBM中NFAT5 mRNA和蛋白水平较高（图4H，I）。NFAT5被证明具有miR-138-5p/miR-432-5p的结合位点（图4J）。然后，克隆NFAT5的野生型和突变体3个未翻译区域序列，分别构建报告质粒和突变体载体。共转染miR-138-5p/miR-432-5p模拟物和报告质粒后，荧光素酶活性显著降低。相反，miR-138-5p/miR- 432-5p模拟物和突变载体共转染对荧光素酶活性没有明显影响（图4K）。因此，本研究结果证实NFAT5是miR-138-5p/ miR-432-5p的直接靶点。

5.CircFOXO3可以调节MiR-138-5p和MiR- 432-5p靶点
   我们测量了这些靶点在circFOXO3 OE或KD后的表达。结果表明，当circFOXO3过表达时，NFAT5的上调最为显著（图5A，B）。鉴于NFAT5与circFOXO3共享MREs，我们通过相关性分析和拯救实验实验，探讨circFOXO3是否通过海绵miR-138-5p/ miR-432-5p调控NFAT5表达，从而发挥其致癌作用。相关分析显示，circFOXO3与NFAT5呈中度正相关（图5C）。此外，circFOXO3与miR-138-5p或miR-432-5p呈中度负相关（图5D，E）。
此外，通过共转染circFOXO3 KD和miR-138-5p和/或miR-432-5p抑制剂U87-MG来进行拯救实验。qRT-PCR和western blot检测显示，与circFOXO3 KD组相比，NFAT5 mRNA和蛋白水平在circFOXO3 KD和miR-138-5p/miR- 432-5p抑制剂共转染的U87-MG细胞中部分升高（图5F，G）。与circFOXO3 KD组相比，miR- 138-5p/miR-432-5p抑制剂共转染的U87-MG细胞的增殖能力增强（图5H）。这些结果表明，抑制miR-138-5p/miR-432-5p可以部分恢复circFOXO3 KD诱导的增殖抑制。同样，circFOXO3 KD也可以部分减弱miR-138-5p/miR-432-5p介导的U87-MG细胞的侵袭的下调（图5I）。

6.CircFOXO3的抑制抑制了异种移植体在体内的生长
   为了确定circFOXO3在体内对GBM进展的影响，我们将circFOXO3 KD或circFOXO3 NC细胞注入麻醉裸小鼠体纹状体。植入后，少数动物开始出现发病迹象，通过MRI对小鼠进行评估以确定颅内肿瘤形成。结果表明，CircFOXO3抑制显著降低了肿瘤的生长和侵袭。引人注目的是，植入circFOXO3 KD细胞的小鼠中位生存期为56.5天，而对照组100%在37天内死亡（图6A-D）。在circFOXO3 KD组中，NFAT5的表达持续下降（图6E，F）。总之，这些结果表明，circFOXO3在体内对GBM的进展至关重要。

总结：
   我们首次证明circFOXO3在GBM组织中过表达，并作为miR- 138-5p/miR-432-5p海绵通过ceRNA机制调节NFAT5的表达，从而在体内外促进肿瘤的发生。我们证明circFOXO3是GBM中一个新潜在的治疗靶点。我们的发现强调了circRNA和miRNA相互作用在肿瘤发生中的重要性。