lncRNA HOTAIR促进外泌体分泌的机制研究

   有研究表明肿瘤细胞在肿瘤发生过程中释放大量传递信息的外泌体。而外泌体分泌是由某些相关分子调节的多步骤过程。lncRNA在肝细胞癌（HCC）进展中起重要作用，但是lncRNA HOTAIR在调节HCC细胞中外泌体分泌中的作用仍不清楚。近期发表在Molecular Cancer（IF：10.679）杂志上的一篇文章介绍了HCC细胞中lncRNA HOTAIR促进外泌体分泌的机制。

技术路线：

主要研究结果：
1、HOTAIR异常表达与外泌体分泌相关
图1A是鉴定出的与外泌体相关的31个编码蛋白。依据中位数将374例肝癌患者分为HOTAIR高表达和HOTAIR低表达两组，GSEA的结果显示外泌体分泌相关的蛋白与HOTAIR高表达相关联（图1B）。RAB35, SNAP23和VAMP3的表达在肿瘤中显著上调（图1C-E）。

2、在肝癌细胞中HOTAIR促进外泌体释放
透射电镜分析纯化的外泌体（图2A），构建过表达的HOTAIR细胞系，检测外泌体标志物CD63和TG101的表达，结果发现过表达HOTAIR后，外泌体中CD63和TG101表达都升高了（图2B）。NTA表明释放的外泌体大小约为100 nm（图2C）。过表达HOTAIR后，细胞分泌的外泌体也增多了。

3、HOTAIR增强了多泡体（MVBs）向质膜的转运
过表达HOTAIR导致CD63在离细胞核更远的地方分布(图3A)，同时也增加了CD63与SNAP-23的共定位（图3B），还增加了细胞中MVB的量（图3C）。说明HOTAIR增强了多泡体（MVBs）向质膜的转运。

4、HOTAIR调控RAB35表达与定位
筛选Rab GTPases（介导MVB运输）的表达时发现，在过表达HOTAIR的细胞系中，RAB35的表达水平显著上调（图4A）。过表达HOTAIR，使RAB35染色增强，CD63与RAB35的共定位增强（图4 B）。RIP实验结果显示，与对照IgG相比，Rab35抗体显著富集HOTAIR(图4C)。HOTAIR促进外泌体分泌的作用在转染HOTAIR和siRAB35之后时效了（图4D）。说明HOTAIR通过调控RAB35的表达和定位来促进MVBs的运动。

5、HOTAIR诱导VAMP3和SNAP23异位
与对照相比，过表达HOTAIR诱导SNAP23向质膜扩散（图5 A），同时增加VAMP3和SNAP23共定位（图5B），说明HOTAIR可以通过影响SNAP23复合物加速MVBs与质膜的融合。

6、HOTAIR通过SNAP23的磷酸化促进外泌体的释放
鉴于前人的研究外泌体释放依赖于SNAP23的磷酸化，因此用反磷酸化实验研究HOTAIR是否可以影响SNAP23的磷酸化。与阴性对照组相比，HOTAIR过表达显著增加了p-SNAP23/SNAP23的比例(图6A)，说明HOTAIR可以诱导SNAP23磷酸化。挽救实验表明当转染细胞与雷帕霉素（SNAP23调节抑制剂）共处理时，HOTAIR诱导SNPA23磷酸化的作用减弱(图6B)。上述表明HOTAIR可以通过SNAP23的磷酸化促进外泌体的释放。