LncRNA PVT1与食管腺癌的关系揭秘

   PVT1在许多肿瘤类型中已作为致癌基因出现。然而，其在Barrett食管（BE）和食管腺癌（EAC）中的作用尚不清楚。本研究的目的是评估PVT1在BE/EAC进展中的作用，并揭示其对EAC的治疗价值。本文通过qPCR检测PVT1在正常、BE、EAC组织中的表达，并进行统计学分析，以确定PVT1表达与EAC（分期、转移、生存）的关系，并检测PVT1反义寡核苷酸（ASOs）的体内外抗肿瘤活性。

结果：
1.PVT1 lncRNA在EAC患者中的过表达与不良预后相关
   首先，利用TCGA数据集分析了多种癌症类型的PVT1基因组改变，我们发现ESCA是第二大癌症类型，存在20% PVT1扩增，约75%的ESCA病例同时存在扩增和重复（图1a）。进一步分析两种主要的ESCA亚型EAC和ESCC，我们发现EAC患者具有相对较高的PVT1扩增，其在西方人群中的发病率也较高，这使我们关注EAC（图1b）。与ESCA中TCGA RNA Seq数据整合后，无论是复制还是扩增，PVT1的遗传改变与PVT1的表达水平显著相关（图1c），提示EC中PVT1的遗传改变导致其mRNA水平上调。为了证实TCGA数据集的发现，接下来，我们用qPCR在我们自己的患者队列中检测PVT1 lncRNA的表达。结果表明，PVT1 lncRNA的表达升高与BE的进展存在显著的相关性（图1d）。而且MYC mRNA在EACs中也显著升高（图1e）。另外，我们发现PVT1表达与临床特征显著相关。如图2a所示，PVT1高表达与高T期、高N期、肿瘤分级不良显著相关。Kaplan-Meier分析显示，与PVT1 lncRNA表达水平较低的EAC患者相比，PVT1 lncRNA表达水平较高的EAC患者总体生存期较短（图2b）。

2.PVT1的抑制抑制了EAC细胞在体内外的生长
   通过qPCR检测PVT1在正常食管上皮细胞系和4个EAC细胞系的表达。与HET-1A细胞系相比，EAC细胞系中PVT1 lncRNA水平明显升高（图3a）。随后，我们评估了人类PVT1特异性ASOs，发现三种PVT1 ASOs （ASO 4、ASO 5和ASO 6）在EAC细胞系中以剂量依赖的方式有效抑制了PVT1的表达（图3b）。为了进一步阐明PVT1 ASOs对EAC细胞的抑制作用，我们在JHESO和OE19细胞中进行了集落形成和细胞迁移实验。结果表明，与未处理或对照组相比，PVT1 ASOs均可显著抑制EAC细胞的集落形成，且呈剂量依赖性（图3c）。同样，细胞侵袭实验显示，PVT1 ASOs处理EAC细胞后，侵袭细胞数量明显减少（图3d）。为了进一步研究PVT1 ASO抑制PVT1是否会影响体内肿瘤生长，裸小鼠皮下注射JHESO细胞。小鼠随机分为对照组和PVT1组。治疗3周后观察肿瘤生长和肿瘤体积。PVT1 ASO组肿瘤体积及重量较对照组明显下降（图3e）。此外，经qPCR检测，PVT1 ASO治疗组肿瘤组织中PVT1的表达较对照组明显下降（图3f）。这些结果证实了PVT1 ASO对EAC的体外和体内抑制作用。

3.PVT1 ASOs抑制EAC细胞的CSC特性
   为了评估PVT1对EAC细胞的CSC特性的影响，我们对暴露于PVT1 ASOs的JHESO和OE19细胞系进行了肿瘤球实验。从图4a和图b可以看出，PVT1 ASOs处理后，与对照组ASO治疗的EAC细胞相比，JHESO和OE19细胞中肿瘤球的形成均明显减少。当ASOs敲除PVT1后，ALDH1A1+细胞数量明显减少（图4c）。此外，ALDH1表达的减少与肿瘤球的大小和数量的显著减少相一致。这些结果提示PVT1 lncRNA与EAC的CSC相关，可能在EAC的肿瘤发生/进展中起关键作用。

4.YAP1对EAC中PVT1的正反馈调节作用
   为了识别EAC中参与调控PVT1的分子通路，我们使用PVT1 ASO对未经处理和处理的EAC细胞系进行了多个信号通路的RPPA分析。结果显示，与对照组细胞相比，经PVT1处理的细胞中YAP1的表达明显下调；相反，磷酸化的YAP1增加（图5a），表明YAP1是PVT1潜在的下游靶标。接着通过qPCR进一步证实了PVT1和YAP1表达之间的相关性，即PVT与YAP1表达显著相关（图5b）。Pearson相关分析表明，YAP1表达与PVT1呈正相关（图5b）。为了进一步证实PVT1与YAP1的正相关关系，我们以PVT1 ASOs为工具，测定EAC细胞系OE19和JHESO中PVT1被抑制后YAP1的变化。如图5c所示，在两个EAC细胞系中，控制YAP1磷酸化和降解的直接上游激酶磷酸化lats1在PVT1 ASO治疗后呈剂量依赖性增加。与之相对应，PVT1 ASO处理的JHESO和OE19细胞中，Ser 127磷酸化的YAP1也显著升高，而YAP1的表达降低（图5c）。免疫荧光染色进一步证实YAP1核表达显著降低，而LATS1磷酸化增加（图5d）。
   为了验证YAP1是否反过来影响PVT1的表达，我们在SKGT-4 EAC细胞中产生了可诱导的YAP1 cDNA表达。如图5e所示，成功诱导YAP1可显著增加PVT1表达，与YAP1水平升高及其下游靶点SOX9、CTGF相关；与此相反，通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术在SKGT-4细胞中高效敲除YAP1，在两个克隆（YAP1 KO1和YAP1 KO2）中显著降低了PVT1的表达，这与YAP1蛋白和mRNA水平的降低有关（图5f）。总之，这些数据表明，PVT1和YAP1都是相关的，并相互积极调节，这可能为EAC的治疗提供一种新的机制上的见解。

5.同时抑制PVT1和YAP1可增强EAC细胞的体内外生长抑制
   为了研究PVT1和YAP1联合抑制是否具有更强的EAC抗肿瘤活性，我们利用PVT1和YAP1特异性ASOs进行了体外和体内实验。如图6a所示，虽然单独使用PVT1 ASO或YAP1 ASO均可显著抑制PVT和YAP1的表达，但二者联合使用ASOs时，二者均可同时抑制PVT和YAP1的表达。在功能上，当用PVT1或YAP1 ASOs处理JHESO和OE19 EAC细胞时，ASO治疗组的菌落形成数量和平均大小均显著减少。此外，与单独使用ASO治疗的EAC细胞相比，联合使用JHESO和OE19细胞的菌落更少（图6b）。这些数据表明，阻断PVT1和YAP1可在体外协同抑制EAC细胞生长。
   为了评价其体内抗肿瘤作用，我们在JHESO异种移植小鼠模型中单独或联合使用PVT1和YAP1特异性ASOs，检测了PVT1和YAP1特异性ASOs的抗肿瘤作用。裸鼠皮下注射JHESO细胞后，随机分为4组（分别用对照ASO、PVT1 ASO、YAP1 ASO和联合ASO治疗）。体内异种移植实验表明，与单纯使用ASO手术治疗相比，同时使用两种ASOs治疗可显著降低肿瘤生长（图6c-e），体重没有明显变化（图6f）。综上所述，这些结果表明在EAC细胞中存在着PVT1和YAP1的相互调控，同时抑制PVT1和YAP1比单独抑制任何一个基因更能有效抑制EAC肿瘤的生长。因此，利用特异性ASOs联合抑制YAP1和PVT1为EAC提供了一种新的治疗策略。

结论：
   PVT1对EAC具有侵袭性表型，是一个较差的预后因子。PVT1和YAP1联合靶向治疗提供了最高的治疗指标，代表了一种新的治疗策略。