m6A甲基化与肝癌之间的奥秘

m6A甲基化与肝癌之间的奥秘

    m6A甲基化是一种众所周知的具有表观遗传新功能的修饰，有报道称其参与了肝癌（HCC）的发生，为该疾病的分子发病机制提供了新的见解。然而，作为m6A甲基化的关键成分，WTAP在HCC中尚未得到很好的研究。在此，我们研究了WTAP在肝癌中的生物学作用及其机制.

本文利用组织芯片和TCGA数据集检测WTAP的表达及其与临床病理特征的关系。通过细胞增殖实验、菌落形成实验、Edu化验和皮下异种移植实验，阐明了WTAP对肝癌细胞的作用。另外，利用RNA测序结合GEO数据筛选WTAP候选靶点。最后，我们通过m6A点印记法、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）、双荧光素酶报告基因检测、RNA免疫沉淀（RIP）和染色质免疫沉淀（ChIP）等方法研究了WTAP在HCC中的调控机制。

结果：

1.    WTAP过表达与肝癌预后不良有关

为了阐明WTAP的作用，我们首先从GEO数据集和TCGA数据中分析了WTAP在人HCC样本中的mRNA表达。结果显示WTAP在肿瘤组织中的表达显著增高（图1a）。WTAP蛋白水平在HCC组织中也明显上调（图1b），经TMA队列IHC染色进一步证实（图1c，d）。此外，探讨了90例HCC患者WTAP表达与临床病理特征的关系。Kaplan-Meier分析显示，WTAP表达水平越高的患者总体生存率（OS）和无病生存率（DFS）越低（图1e）。而且WTAP的过表达被发现是HCC患者的OS 和DFS 的独立预后因素（图1f）。综上所述，我们的结论是WTAP在HCC中上调，并与其不良预后密切相关。

2.  WTAP在体内外均能促进肿瘤的增殖和致瘤能力

CCK-8和集落形成试验表明，WTAP缺乏抑制了三种细胞系（Huh7，Hep3B，PLC/PRF/5）的增殖能力（图2 a-c）。此外，EdU分析暗示敲低WTAP会减缓细胞生长（图2 d）。

为了证实WTAP在体内的作用，我们通过皮下注射HCC细胞，在裸鼠体内稳定敲低（shWTAP #1， #3）或过表达WTAP （WTAP- oe），构建了肿瘤异种移植模型。我们发现WTAP损耗抑制肿瘤发生（图2 e），显著降低肿瘤体积和重量（图2 f，g）。与此同时，WTAP的强迫表达导致异种移植小鼠的表型逆转（图2h-j）。综上所述，我们认为WTAP在HCC中具有肿瘤促进作用。

3.ETS1被认为是HCC中WTAP的潜在靶点

为了了解WTAP在HCC中发挥肿瘤促进作用的潜在机制，我们采用转录组测序来阐明WTAP敲除细胞的转录改变。WTAP缺失后，层次聚类显示上调基因1636个，下调基因794个（图3a）。为了缩小下游靶点的范围，我们整合Liu等人发表的GEO数据（GSE46705）。通过MeRIP -seq和CLIP-seq对WTAP调控的转录本进行精化，建立基因集重叠。维恩图共揭示了15个基因（图3b）。然后我们进行RT-qPCR来评估WTAP对每个候选基因的影响。其中，在WTAP沉默后，ETS1和ETS2持续显著上调，当WTAP过表达时，ETS1和ETS2均适度下调（图3c-e）。然而，western blot分析显示，WTAP失活明显导致ETS1蛋白水平升高，而不是ETS2蛋白水平升高（图3f，g）。接着我们进一步证明，在Hep3B和HCCLM3细胞中，WTAP对ETS1的含量有相反的影响（图3h，i）。因此，我们推测ETS1功能障碍可能是WTAP介导的HCC增殖特征的原因。

4. WTAP增加了ETS1 mRNA的m6A修饰，并以m6A-HuR介导的方式抑制ETS1的表达

为了确定ETS1的m6A修饰是否通过WTAP介导，我们首先通过两种不同的方法（m6A斑点印迹法和RNA甲基化定量法）检测阴性对照组和稳定的WTAP敲低组的m6A的整体水平。结果表明，随着WTAP的缺失，两株HCC细胞系m6A水平显著降低（图4a，b）。通过MeRIP-qPCR检测m6A在ETS1中的富集情况。发现与IgG对照相比，m6A特异性抗体较强地富集了ETS1转录本。此外，我们发现在WTAP沉默后，m6A修饰的ETS1显著减少（图4c）。因此，我们认为WTAP能够影响m6A的总体水平，尤其是ETS1。

为了证实m6A修饰ETS1的要求，我们用野生型（WT）和两个突变体（Mut）质粒进行了荧光素酶报告基因测定。对于Mut报告基因，预测m6A位点的几个腺苷碱基（A）被胞嘧啶碱基（C）取代，以消除m6A甲基化的影响，而WT报告基因包含完整的m6A位点（图4d）。正如所料，WT组的荧光素酶活性在WTAP敲低作用下适度增强，而Mut组的荧光素酶活性对WTAP沉默的影响具有一定的抵抗作用（图4e），说明ETS1的调控受WTAP诱导的m6A修饰的控制。总之，这些数据表明WTAP足以调控ETS1 mRNA的m6A修饰。

RNA结合蛋白HuR易于与较少的m6A修饰的RNA结合，并稳定其结合的对应物，因此我们认为HuR可能调控ETS1。结果表明，HuR的减少显著减轻了ETS1的表达（图4f）。我们发现，与IgG对照组相比，HuR特异性抗体显著富集ETS1 mRNA，而WTAP的抑制显著增强了ETS1 mRNA的富集（图4g）。此外，WTAP敲低引起的ETS1升高可以通过HuR的衰减来恢复（图4h）。我们还发现，敲除WTAP可以延长ETS1 RNA的半衰期，而HuR沉默可以逆转这种效果（图4i）。最后，我们还进行了荧光素酶报告基因测定，以确定HuR参与m6A的修饰。在WT组中，HuR可以挽救WTAP沉默引起的荧光素酶活性的增强。然而，当ETS1的m6A位点可能发生突变时，HuR表达的改变似乎对荧光素酶活性没有影响（图4j）。总之，我们的发现表明WTAP通过m6A- HuR依赖的通路抑制ETS1。

5. ETS1作为一种肿瘤抑制因子，逆转了WTAP在HCC中的作用

与癌旁组织相比，肿瘤组织中ETS1的表达较低（图5a，b）。通过对cohort1的免疫组化染色，我们发现邻近组织的阳性率明显较高（图5c，d）。根据TCGA数据，ETS1水平越高，预后越好（图5e）。体外功能验证表明，ETS1的敲除增强了MHCC97H、HCCLM3和Huh7细胞的增殖能力（图5f，g）。此外，ETS1沉默足以挽救WTAP敲低对HCC细胞生长和存活的抑制作用（图5h，i），因此ETS1的失活可能通过WTAP-ETS1轴导致HCC的进展。

6. WTAP的沉默通过ETS1-p21/p27轴在HCC中引起G2/M阻滞

据报道WTAP参与细胞周期调控，因此我们拟探讨其在HCC中的相关机制。结果表明，WTAP敲低导致了G2/M的大量阻滞（图6a，b）。为了阐明潜在的机制，我们研究了与细胞周期相关的几个元素。有趣的是，当WTAP在转录水平失活时，在细胞周期和增殖中发挥重要作用的肿瘤抑制因子p21和p27的表达显著增加（图6c、d）。同时，western blot分析发现WTAP敲低上调了p21和p27，同时下调了CDC25C、CDK1、cyclin-A2和cyclin-B1。相反，WTAP的过表达减轻了p21和p27的表达，降低了G2期所有指示的检查点蛋白的放大（图6e）。

为了进一步研究ETS1是否参与WTAP诱导的细胞周期效应，我们进行了一系列的挽救性实验。结果表明抑制ETS1可显著逆转WTAP沉默引起的G2/M阻滞（图6f）。此外，ETS1的下调导致p21和p27的减少（图6h）。而且我们推测ETS1可能增强p21和p27的转录，因为ChIP实验表明ETS1可以与启动子结合（图6i）。此外，ETS1的抑制恢复了WTAP抑制引起的p21和p27表达升高（图6j，k），这些数据表明ETS1-p21/p27轴在HCC中对WTAP依赖的细胞周期调控至关重要。

7.结合高WTAP和低ETS1表达预测肝癌的不良预后

为了评估WTAP和ETS1的临床相关性，我们对来自cohort1的相同HCC标本进行了WTAP和ETS1染色的IHC检测。近65.2%的高WTAP表达的样本ETS1染色较弱，而大约55.6%的低WTAP表达的样本表现出更强的ETS1染色（图6a，b）。基于这两种因素结合的Kaplan-Meier分析进一步证明，WTAPhighETS1low表达的HCC患者的总体生存率比其他任何组都要低（图7c）。综上所述，WTAP与ETS1在临床样本中呈负相关关系，WTAP与ETS1的共表达模式可能是判断HCC预后的一个有效因素。

总结：

总之，我们的研究阐明了WTAP和活化的WTAP介导的m6A机制在HCC中的致癌作用。WTAP上调参与了ETS1的m6A修饰，随后通过HuR关联的方式使ETS1表观遗传沉默。我们的发现丰富了肿瘤特征中m6A甲基化的功能价值，为探索肝癌治疗中有效的治疗策略开辟了潜在的途径。