人肺腺癌和鳞状细胞癌中环状RNA的RNA-Seq分析
导语：
新兴证据表明，环状RNA（circRNA）在肿瘤中异常表达，可以作为癌症的预后标志物。但是，circRNA在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达模式和临床意义仍然不清楚。在这项研究中，分析了10对肺腺癌(LUAD)和鳞状细胞癌(LUSC)患者中核糖体RNA缺失和富集circRNA的RNase R消耗后环状RNA的表达情况。从而探索circRNA在NSCLC中的重要诊断潜力。
技术路线：
1.人肺肿瘤及其邻近的正常组织的收集与获取
2.人肺肿瘤及其邻近正常组织中的CircRNA分析
3.鉴定和验证LUAD和LUSC组织中差异表达的circRNA
4.circRNA的验证和定量，circRNA用于NSCLC诊断的潜在生物标志物
研究结果：
1、人肺肿瘤及其邻近正常组织中的CircRNA分析
RNase R消化后，从NSCLC肿瘤及其相应的正常组织中提取10对RNA样品，进行高通量RNA测序。在所有5个程序中总共发现了17,952个circRNA，其中近98.84％包含至少2个独特的反向拼接reads（图1a，附图S1a）。可以观察到，这些重叠的circRNA普遍存在于整个基因组区域（图1b）。如图1c所示，与筛选出的circRNA相对应的将近60.8％的宿主基因可以产生至少2个circRNA。尽管无处不在整个基因组区域，但大多数circRNA都是从外显子区域反向剪接的，主要（77.4％）由2-5个外显子组成（图1d）。此外，大多数circRNA的长度（91.7％）在200至1200个核苷酸之间（图1e；附加文件2：表S5）。在这些筛选出的circRNA中，已经在circBase数据库中记录了15,359个，其中包含140,790个人类circRNA[5]，因此2593个被认为是新颖的（图1f）。
2、鉴定和验证LUAD和LUSC组织中circRNA的差异表达
比较NSCLC肿瘤中circRNA的表达与其相应的正常组织中的circRNA的表达，发现50个circRNA在LUAD组织中差异表达，校正后的p值≤0.05，倍数变化≥2（图2a，附加文件3：图S2a）。使用相同的严格标准，观察到172个circRNA在LUSC组织中具有明显的差异表达（图2a，附加文件3：图S2b），并且26个circRNA在LUAD和LUSC组织中均差异表达（图2b）。为了验证，使用跨越各自连接位点的F1 / R1特异性异源引物组对每个circRNA进行PCR（图2c和g，附加文件3：图S3a和g）。PCR产物的Sanger测序结果证实了所有4个选定circRNA的反向剪接连接位点的存在（图2d和h，附加文件3：图S3b和h），与circBase一致。然后，我们使用不同的F2 / R2发散引物对每个circRNA进行qPCR，其中F2穿过各自的circRNA连接位点。LUAD和LUSC组织中hsa_circ_ 0001821的上调和hsa_circ_0077837的下调首次在分析样本中得到验证（图2e和i），然后在独立的患者样本队列中得到证实（图2f和j）。同样，已确认hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495在NSCLC肿瘤中以亚型特异性模式异常表达，即hsa_circ_0001073仅在LUAD组织中被下调，而hsa_circ_ 0001495仅在LUSC组织中表现出较高的表达（其他文件3：图S3c-f，il）。这些不同，circRNA的NSCLC亚型特异性失调表明了它们的亚型特异性生物学功能。
3、circRNA在NSCLC诊断中的潜在生物标志物
如图3a和b所示，曲线下面积（AUC）可以将NSCLC与正常组织区分开，hsa_circ_0077837的曲线下面积为0.921（95％CI：0.868-0.975），而hsa_circ_0001821的曲线下面积为0.81（95％CI：0.797-0.929），暗示这两种circRNA在NSCLC患者中具有较高的诊断潜力。另一方面，LUAD组织中hsa_circ_0001073的AUC为0.919（图3c），LUSC组织中hsa_circ_0001495的AUC为0.965（图3d），这意味着hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495已在NSCLC亚型中异常表达。这种特异性模式可以用作诊断生物标志物，分别预测LUAD和LUSC。
总结:
在这项研究中，我们分析了NSCLC中circRNA的表达，包括LUAD和LUSC肿瘤及其邻近的正常组织，发现LUAD和LUSC组织不仅具有共同的差异表达模式，而且还具有独特的circRNA表达特征。此外，ROC分析表明，hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821对NSCLC非小细胞肺癌患者具有诊断潜力，而hsa_circ_ 0001073和hsa_circ_0001495可作为NSCLC非小细胞肺癌病理亚型的生物标志物。