新发现-YTHDF2可促进肝细胞癌的炎症和血管异常

   YTHDF2（YTH域家族2）是最有效的m 6通过识别和分发米削弱mRNA稳定性的读取器6含有A-mRNA的一种处理机构。最近的报告称为YTHDF2是能够降解两种肿瘤启动子和抑制基因的mRNA。虽然它增强了白血病干细胞的自我更新，但内源性YTHDF2在实体癌中的基本作用仍存在疑问。
   尽管在许多人类癌细胞系中发现了成千上万个m6A位点，但对于癌症进展过程中的表观基因组改变以及任何特定类型的癌症患者中的转录组特征，人们所知甚少。癌细胞的代谢特征对于适应肿瘤微环境内的变化至关重要，通常有助于表观遗传可塑性。作为最公认的癌标志之一，缺氧可通过降低的酶活性，调节基因表达或增加代谢物产生[影响DNA甲基化和组蛋白甲基化或乙酰化。以m6A-mRNA编辑，缺氧诱导因子（HIF）上调ALKBH5表达，从而导致乳腺癌细胞中NANOG mRNA脱甲基。尽管如此，oncometabolite 2-羟基（2HG）衰减FTO活性，从而增加全球米6在2HG敏感白血病或神经胶质瘤细胞中。另一项研究报道，缺氧广泛地增加了对mRNA的m6A修饰，导致获得了更高的mRNA稳定性，而不是m6A介导的衰变。这些发现都表明肿瘤缺氧导致了m6A表观遗传重塑，但尚未确定普遍的改变和触发这些改变的分子。
   今年11月份，Jiajie Hou等人在Mol Cancer发表一篇 “YTHDF2 reduction fuels inflammation and vascular abnormalization in hepatocellular carcinoma”的SCI文章。这篇文献确定了人类肝癌标本和缺氧细胞系中m6A修饰的特征增益与mRNA表达的增加有关。在整个转录组中，这些“过度上调”的基因与癌症进展的分子重排显着相关。预测HCC（肝癌）患者分类和预后不良的YTHDF2的减少与这种转录编排高度相关，并促进肿瘤的生长和转移。进一步揭示由THDF2的转录抑制HIF-2α，在肾细胞癌和肝癌已被应用于靶向治疗。 HIF-2α拮抗剂（PT2385）的给药得以恢复，并需要YTHDF2来抑制炎症相关的癌症进展。总之，该文献强调了YTHDF2在HCC中具有阻断低氧诱导的表观遗传-炎症-癌症轴的保护作用。
技术路线：

一、人类HCC在m 6 A-mRNA景观中表现出“高变”变化

人类HCC中m6A-mRNA的过度上调和YTHDF2的下调。（a）使用LC-MS/MS评估，成对的肿瘤和癌旁mRNA中的m6A水平。n=37例患者。（b）通过MeRIP-Seq测定，与副肿瘤相比，肿瘤中m6A-mRNA改变的百分比（分类为低表达，低表达，高表达和高表达）。n=8位患者。（c）通过RNA-seq确定的配对肿瘤与副肿瘤mRNA中的缺氧签名基因表达的基因集富集分析。n=8位患者。NES，标准化富集得分。（d）米6使用LC-MS/MS评估，在缺氧条件下生长0、6、12或24h的人类HCC细胞系的mRNA表达水平。n=2个独立实验。（e）使用MeRIP-Seq检测到，缺氧（Hx）与正常氧（Nx）24小时后，SMMC7721细胞m6A峰的变化。在P<0.05和5％FDR调整下，突出显示（紫色）或丢失（浅蓝色）m6A的峰。（f）在低氧或常氧条件下，不同转录片段中m6A峰的分数。（g）高甲基化峰中mRNA的表达变化。（h）YTHDF2在配对的肿瘤（T）和副肿瘤（P）组织中的免疫印迹。ñ=7位患者。（i）通过RT-qPCR评估的成对的肿瘤和癌旁组织中的YTHDF2mRNA水平。n=51位患者。（j）散点图，显示m6A水平与YTHDF2表达之间的相关性。显示了线性最佳拟合线，皮尔逊相关系数（r）和P值（P）。n=37例患者。（k）Kaplan-Meier分析YTHDF2表达水平与HCC患者的总生存（左）或无复发生存（右）之间的相关性。n=总共200名患者。误差线表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通过两个尾部t检验确定P值

二、YTHDF2与HCC转录组和临床结果相关

（a）通过CCK8评估5d生长的SMCMC7721-shCtrl和SMMC7721-shYTHDF2细胞的增殖活性（左），或通过正常氧（Nx）或缺氧（Hx）的另外24h的生长并通过WST1分析评估的增殖活性（右）。n=4–6个生物学重复。（b）在Nx或Hx下，将HUVEC与所示SMMC7721细胞共培养24h形成的内皮管的数量。n=3个生物学重复。（c，d）将指示的SMMC7721（c）或MHCC97H（d）细胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指定的日期测量肿瘤体积。ñ=5–6只老鼠。（e）肺组织的H＆E染色，显示转移结节起源于MHCC97H细胞。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（f）SMCD7721衍生肿瘤中的微血管密度（MVD），通过CD31染色和微血管区域定量评估。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（克）血管拟态在MHCC97H衍生的肿瘤，如通过PAS的数字量化+CD31-肿瘤细胞内衬通道。n＝5只小鼠。比例尺，100μm。（h-j）肉眼观察（h），肿瘤数目（i）和8.5个月大的注射DEN和CCL4的Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肝脏的最大肿瘤大小。n=7–9只小鼠。（j）Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肺中转移结节的H＆E染色。n=7–9只小鼠。比例尺，50μm。（k）CD31和NG2的免疫荧光染色，显示Ythdf2F/F和Ythdf2LKO小鼠肝脏中的微血管和周细胞覆盖。n=7–9只小鼠。比例尺，50μm。误差线表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通过两个尾部t检验确定P值。

三、YTHDF2缺乏症加剧了炎症和血管异常

（a）火山图，显示了SMMC7721-shYTHDF2与SMMC7721-shCtrl细胞中（红色）或（蓝色）下调的基因，通过RNA序列评估。（b）基于（A）中的RNA-seq的GO分析，显示了最重要的GO项和P值。（c）筛选策略显示出一组重叠基因，它们在YTHDF2缺陷诱导的上调和缺氧诱导的上调同时发生。（d，g）显示在STAT3磷酸化（d）和SerpinE2（g）表达的指示的SMMC7721细胞在Nx或Hx下生长24小时的免疫印迹。ñ=2个独立实验。（e）在Nx或Hx下生长24h的SMMC7721细胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相对mRNA水平的RT-qPCR分析。n=3个生物学重复。（f）在Nx或Hx下生长24小时的所指示SMMC7721细胞的培养上清液中IL-11的定量蛋白质水平的ELISA分析。n=3个生物学重复。（h）如通过RNA-seq评估的，在低氧下生长12小时的SMMC7721-OE细胞与SMMC7721-EV细胞中显示出上调（红色）或下调（蓝色）的基因的火山图。（我RT-qPCR分析在Hx下生长0、6、12或24h的SMMC7721-EV和SMMC7721-OE细胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相对mRNA水平。n=3个生物学重复。（j）显示在指定的SMMC7721细胞中在Nx或Hx下生长24小时的STAT3磷酸化的免疫印迹。n=2个独立实验。误差线表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通过两个尾部t检验确定P值。

四、YTHDF2降解m 6含IL11和SERPINE2 mRNA

（a）通过MeRIP-qPCR评估，SMMC7721细胞中表达空载体（EV）或过表达YTHDF2（OE）的IL11和SERPINE2mRNA中的m6A富集。使细胞经受Nx或Hx12小时。n=3个生物学重复。（b）通过RIP-qPCR测定，从SMMC7721-OE细胞免疫沉淀的YTHDF2-mRNA复合物中IL11和SERPINE2的基因富集。使细胞经受Nx或Hx12小时。n=3个生物学重复。（c，d）通过监测转录抑制（TI）后的转录物丰度确定，在指定的SMMC7721细胞中IL11和SERPINE2的RNA寿命。在TI引发之前，将细胞进行Nx或Hx处理8小时。n=3个生物学重复。（e）平均读取密度，显示使用MeRIP-seq评估的人HCC组织中IL11和SERPINE2转录物中鉴定出的m6A峰。n=8位患者。（f）荧光素酶报告基因测定，显示在IL11（左）或SERPINE2（右）3'UTR存在下，YTHDF2对转录后的调控。指示的SMMC7721细胞在Nx或Hx下生长12小时。雷尼利亚将萤光素酶活性标准化为萤火虫活性，并表示为相对萤光素酶活性。n=3个生物学重复。（g）YTHDF2和DCP1a（P体标记）在Nx或Hx下生长12h的SMMC7721细胞的免疫荧光染色。n=3个生物学重复。比例尺，5μm。（h）在Nx或Hx下生长12小时的所示SMMC7721细胞中IL11或SERPINE2mRNA的荧光原位杂交和DCP1a的免疫荧光染色。n=3个生物学重复。比例尺，5μm。误差线表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通过两个尾部t检验确定P值

（a）将空载体（EV）或编码野生型（WT）或突变型YTHDF2的载体（W432A和W486A）转导到具有YTHDF2-敲低（KD）背景的SMMC7721细胞中。通过CCK8（左）或WST1分析（右）评估了指示的SMMC7721细胞的增殖活性。n=5个生物学重复。（b）通过HUVEC与指定的SMMC7721细胞在Nx或Hx下共培养24小时共培养形成的内皮管的数量。n=3个生物学重复。（c）在Nx或Hx下生长24小时的SMMC7721细胞中IL11（左）和SERPINE2（右）的相对mRNA水平的RT-qPCR分析。n=3个生物学重复。（d）在Nx或Hx下生长24小时的指示SMMC7721细胞中培养上清液中IL-11定量蛋白质水平的ELISA分析。n=3个生物学重复。（e）显示在指定的SMMC7721细胞中在Nx或Hx下生长24小时的STAT3磷酸化和SerpinE2表达的免疫印迹。n=2个独立实验。（f）将指示的SMMC7721细胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指定的日期测量肿瘤体积。n＝5只小鼠。（克）将靶向IL11和SERPINE2的对照shRNA或shRNA导入YTHDF2-nockdown（KD）背景的SMMC7721细胞。通过CCK8（上）或WST1分析（下）评估指定的SMMC7721细胞的增殖活性。n=5个生物学重复。（h）由HUVEC与所示SMMC7721细胞共培养形成的内皮管的数量。n=3个生物学重复。（i）将指示的SMMC7721细胞皮下注射到NPG小鼠中，并在指示的时间点测量肿瘤体积。n＝5只小鼠。（j）人肝癌组织阵列中IL-11和SerpinE2的免疫组织学染色，分为YTHDF2低和YTHDF2高根据YTHDF2的中值综合光密度（IOD）值进行分类。n=143位患者。比例尺，200μm。误差线表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通过两个尾部t检验确定P值

五、缺氧以HIF-2α依赖性方式中断YTHDF2表达

（a）YTHDF2和pimonidazole（PIMO）在SMMC7721衍生的小鼠肿瘤中的免疫荧光染色。缺氧肿瘤区域通过PIMO染色进行标记。n=3个生物学重复。比例尺，20μm。（b）YTHDF2在用对照siRNA（siCtrl）或靶向HIF-1/2α的siRNA转导的SMMC7721细胞中的免疫印迹，并在Nx或Hx下生长24小时。n=2个独立实验。（c）在Nx或Hx暴露24小时后，表达指定siRNA的SMMC7721细胞中YTHDF2的RT-qPCR分析。（d）富集人缺氧反应因子（HREs）的人类Ythdf2片段通过ChIP-qPCR确定DNA-HIF-2α复合物中的启动子。n=4个生物学重复。（e）如使用荧光素酶测定法定量的，在表达指示的siRNA的SMMC7721细胞中Ythdf2启动子活性。将海肾荧光素酶活性标准化为萤火虫活性，并表示为相对荧光素酶活性。n=3个生物学重复。（f）如通过WST1测定所评估的，用媒介物或PT2385（10μM）处理的所指示的SMMC7721细胞的增殖活性。n=3个生物学重复。（g）在指定条件下共培养HUVEC形成的内皮管的数量。n=3个生物学重复。（h，j）YTHDF2（h）和p-STAT3（j）在用载体或PT2385（10μM）处理的SMMC7721细胞中的免疫印迹。n=2个独立实验。（i）RT11q分析IL11（左）和SERPINE2（右）mRNA水平。n=3个生物学重复。（k，l）具有SMMC7721-shCtrl（K）或SMMC7721-shYTHDF2（L）细胞的NPG小鼠在达到200mm3的平均肿瘤体积后用Vehicle或PT2385（20mg/kg/d）口服处理。在指定的治疗日期连续测量肿瘤体积。n＝6只小鼠。误差线表示平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。通过两个尾部t检验确定P值