乳腺癌中KLK6蛋白酶介导的生化途径

   激肽释放酶相关的肽酶6（KLK6）是一种丝氨酸蛋白酶，通常在乳腺组织中表达，在乳腺癌中受到异常调节。在生理水平上，KLK6发挥乳腺癌的抑制作用，而其异常的过表达（比正常水平高50倍以上）是一部分乳腺癌的特征，并与严重的联合免疫缺陷小鼠的原发性乳腺肿瘤的加速生长有关。
主要结果如下：
1、实验设计
   实验设计中作者选择了其本身不表达KLK6且重表达KLK6也不降低其它KLKs表达的细胞系MDA-MB-231为亲本。C5为KLK6,C21与侵袭表型相关，可见KLK6对MDA-MB-231细胞致瘤表型呈现出剂量依赖性规律(图1B–D)。尾静脉实验显示，C5细胞向肺转移的效率与PAR细胞相似，而C28细胞不转移(图1E)，KLK6影响乳腺癌细胞的肺部定值也表现出剂量依赖性。

                                   图1 剂量依赖性的KLK6表达恢复降低了MDA-MB-231细胞的体内和体外外致瘤性

2、蛋白组学表达谱
   MDA-MB-231为亲本（PAR），C5为KLK6高表达细胞系，C28为KLK6生理正常表达细胞系。C28的平均光谱计数为24.94，C5的平均光谱计数为16.54，PAR的平均光谱计数为20.56。从这三个样本中共计鉴定出3639个蛋白质，而三个样本共有的蛋白质为2449（图2A, B）。三个样本中蛋白质的数量分别为：PAR有3628个，C28有3312，C5有2731个。以95%的概率统计，共有1814个蛋白同时存在于三个样本中（图2C）。C5和C28中发现的蛋白相对于PAR的相对表达水平如图2D所示，蛋白表达改变可以分为三个类别：与KLK6表达水平无关的蛋白；表达量呈KLK6浓度依赖性下降或上升的蛋白；表达受KLK6影响呈现钟形表达的蛋白质。最后一类可以解释为什么当在相对于过表达的生理水平上重新表达时，KLK6对MDA-MB-231表型产生不同的作用。蛋白质组学分析结果通过p53，p65，α-微管蛋白和消去蛋白的WB得到验证（图2E）。

                                           图2 MDA-MB-231细胞的蛋白质组学特征

   然后，作者使用IPA分析了C5和PAR或C28和PAR之间差异倍数大于4倍的蛋白质以寻找在C5和C28细胞之间差异激活或失活的途径（图3）。

                                                    图3 分子途径

3、KLK6在生理水平上的重新表达降低了S100蛋白的表达
   S100A蛋白在C28细胞中表达下调，而在C5、S100A4和S100A11细胞中表达上调(图4A)。S100蛋白相对于KLK6表达的钟形表达模式可以解释为什么C5细胞与C28相比具有向肺转移的能力。对KLK6的表达与S100蛋白表达的相关性进行了临床探索，生理性KLK6水平与S100A11和S100A14呈负相关（图4B，C）。而在基底样癌中，KLK6与S100A11和S100A2呈正相关（图4B，C）。

                                             图4 KLK6影响S100A蛋白的水平

4、生理水平的KLK6可诱导凋亡相关蛋白的表达
   C28细胞凋亡相关蛋白表达上调，C5细胞凋亡相关蛋白表达下调(图5)。凋亡介导蛋白（例如CASP8和CASP7）在C28细胞中表达的增加可能是其致瘤性降低的原因。乳腺癌临床数据集分析显示，KLK6表达与BCL成员表达具有相关性(图5)。

                                           图5 KLK6影响与凋亡相关的基因

5、KLK6的重新表达降低了RAB蛋白的表达
   RABs是调节囊泡运输和细胞内通讯的细胞内运输蛋白。由于异常的转运与细胞极性的丧失、增殖的增加、细胞的运动和侵袭有关，因此囊泡转运对上皮细胞的癌变具有重要意义。MDA-MB-231中RABs的表达具有较高的异质性：部分RABs成员表达在C28中略有下降，在C5细胞中表下降显著，而其他RABs成员在C5和C28细胞中均有升高(图6)。RAB表达的变化表明C5和C28细胞中的小泡运输重组，并且RAB在C5中显著下调但在C28中几乎保持不变（图6中的阴影框），这可能与细胞的转移能力和致瘤性有关。乳腺癌临床数据集分析显示，KLK6表达与RAB26、RAB17和RAB30呈负相关(图6)。

                                            图6 KLK6影响RAB蛋白的表达

6、KLK6与多种角蛋白协同表达
   角蛋白(KRTs)参与EMT，可能参与肿瘤的侵袭和转移。作者发现C5和C28细胞中KRT8和KRT18的上调，这与恢复MDA-MB-231中KLK6表达后诱导的间质到上皮的转变有关。此外，作者还发现KRT81在过表达KLK6的C5细胞中上调，在低表达KLK6的C28细胞中下调。 该发现的生理学意义尚不清楚，但可能表明KRT81促进肿瘤发生。 乳腺癌临床数据分析表明，KRT表达与KLK6相关（正向或反向），包括KLK6和KRT18的反向相关。此外，作者还发现KLK6的重表达导致MDA-MB-231中核糖体蛋白水平降低，并引起了分泌金属蛋白酶活性的变化。

7、生存分析
   使用两个综合评分分析，即KLK6 + S100B-S100A7和KLK6 + S100B-S100A14-S100A16，以预测乳腺癌患者的长期生存（图7A，B）。对于KLK6 + S100B-S100A7而言，得分低的乳腺癌患者比得分较高的乳腺癌患者有更长的生存期。因此，可以利用这种评分模式寻找诊断应用的方法。

                                              图7 总体生存(OS)评分
   综上所述，作者发现KLK6对乳腺原发肿瘤的生长和转移具有浓度依赖性。具体来说，当KLK6的表达水平与正常乳腺细胞分泌的水平相当时，它可在体内抑制原发肿瘤的形成和肺转移。另一方面，KLK6过表达是乳腺癌的一个亚型，它促进了体内原发性肿瘤的发生和肺转移。此外，本文也是首次将KLK6的致瘤性与S100A和凋亡介导蛋白的表达联系起来的研究。
参考文献：
   Pampalakis Georgios., Zingkou Eleni., Sidiropoulos Konstantinos Gus., Diamandis Eleftherios P., Zoumpourlis Vassilis., Yousef George M., Sotiropoulou Georgia., (2019). Biochemical pathways mediated by KLK6 protease in breast cancer. Mol Oncol, 13, 2329-2343.