miR-541通过抑制自噬增强人肝癌对索拉非尼治疗的反应

   自噬在HCC中也起着多方面的作用，包括促进肿瘤发生、维持肿瘤生长、促进转移以及对索拉非尼治疗的适应性反应。miR-541的临床意义及其对自噬的影响尚未被探讨。在这里，小编与大家分享一篇近期发表与Gut上的文章“miR-541 potentiates the response of human hepatocellular carcinoma to sorafenib treatment by inhibiting autophagy”。在本项研究中，我们通过调节miR-541启动的miRNA-自噬轴，研究了肝癌细胞对索拉非尼致敏的可行性。

结果：
1.miR-541的下调与HCC患者生存期的缩短和复发的增加有关
   我们首先通过在www. kmplot. com上搜索来研究miR-541在HCC患者中的预后价值。发现较低的miR-541水平与HCC患者较短的总生存期（OS）相关（图1A）。我们使用RT-PCR进一步验证了miR-541在HCC中的表达的临床意义。研究表明，与周围非肿瘤肝组织相比，肿瘤组织中miR-541的表达明显下降（图1B）。在大多数病例中观察到miR-541的下调（图1C）。临床病理分析表明，miR-541在人肝癌细胞中的下调与侵袭性临床病理特征显著相关。与www. kmplot. com上的结果一致，这些HCC样本中较低的miR-541水平也与HCC患者较短的OS相关（图1D）。此外，低miR-541表达组的复发率明显高于高miR-541表达组（图1 E）。关键的是，我们证实低水平的miR-541与较短的无复发生存期相关（图1F）。基于这些数据，miR-541的表达在临床上与癌症复发和患者预后相关。

2.miR-541在体内外抑制肝癌细胞的恶性特性
   我们通过转染miR-541模拟物或miR-541抑制剂的细胞，在体外评估了miR-541对人肝癌细胞系各种恶性特性的影响。过表达miR-541可显著抑制体外肝癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭（图2A-E）。相反，miR-541的抑制增加了HCC细胞的恶性表型。
   在HCC皮下植入肿瘤模型中，所有接受细胞感染Ad-Max的小鼠在接种后第4天即检测到移植瘤，而接受细胞感染Ad-miR-541的小鼠仅观察到一个结节。此外，Ad-miR- 541组的肿瘤生长和肿瘤重量显著降低（图2F-H）。另外，我们还通过向NOD/SCID小鼠体内注射被Ad-miR- 541或Ad-Max感染的荧光素酶标记的YY-8103细胞，研究了miR-541对体内HCC转移的影响。使用体外成像在Ad-Max组的9只小鼠中有5只在骨骼中检测到荧光素酶信号，但在Ad-miR-541组的10只小鼠中只有10只中有2只在骨骼中检测到（图2I，J）。同样，在Ad-Max组的9只老鼠中，3只老鼠的肺中检测到了荧光素酶信号，而在Ad-miR- 541组的10只老鼠中，只有1只老鼠的肺中检测到了荧光素酶信号。组织学分析证实Ad-miR- 541组的骨和肺中存在较小的肿瘤病灶（图2K）。这些数据表明，miR-541在HCC中具有强大的肿瘤抑制作用。

3.miR-541在体内外抑制肝癌细胞的自噬
   我们研究了miR-541对HCC细胞自噬的影响。研究表明miR-541过表达降低了HCC细胞中LC3 II的水平，提高了P62的水平（图3A）。相反，miR-541的抑制增加了LC3 II的水平，降低了P62在HCC细胞中的表达。免疫化学染色显示，与经Ad-Max处理的异种移植相比，经Ad-miR- 541处理的皮下异种移植中LC3阳性肿瘤细胞较少，P62阳性肿瘤细胞较多（图3 B，C）。TEM表明Ad-miR-541肝癌细胞的自噬小体数量减少（图3 D，E）。此外，使用mRFP-GFP-LC3报告基因构建的活细胞成像显示，自噬通量的速率被miR-541过表达显著抑制，被miR-541耗竭增强（图3F，G）。

4.ATG2A和RAB1B是miR-541的两个直接靶点
   我们进行了生物信息学分析，以识别可能参与自噬的miR-541候选mRNA靶点，并探讨miR-541抑制自噬的机制。分析显示miR-541与ATG2A和RAB1B之间的miRNA-target相互作用，它们是自噬的重要调控因子（图4A，B）。有趣的是，miR-541异位表达后，肝癌细胞中ATG2A和RAB1B mRNA和蛋白水平下降，miR-541抑制后则升高（图4 C，D）。通过miRNA预测程序，我们确定了ATG2A mRNA的3’UTR中miR-541的两个预测结合位点，以及RAB1B mRNA的3’UTR中miR-541的四个潜在结合位点（图4 A，B）。与我们的预测一致，miR-541的过表达降低了含有野生型ATG2A和RAB1B 3’UTR的构建体的荧光素酶活性，而3’UTR上所有靶序列的点突变均减弱了miR-541对荧光素酶活性的影响，这表明这两个基因代表miR-541的直接靶标（图4E，F）。此外，western blot和免疫组织化学染色检测到，miR-541水平的升高伴随着ATG2A和RAB1B蛋白表达的降低（图4 G，H）。在HCC样本中，ATG2A和RAB1B水平与miR-541水平呈负相关（图4I，J）

5.ATG2A和RAB1B在HCC细胞中具有致癌作用并促进自噬
   迄今为止，ATG2A和RAB1B在HCC中的真实作用尚不清楚。为了研究miR-541发挥抗肿瘤作用的潜在分子机制，我们首先在www. kmplot. com中检测了这两个基因在HCC患者中的预后价值。生存曲线显示ATG2A和RAB1B mRNA的高表达与较差的预后之间存在关联，这与miR-541的临床意义相反（图5 A，B）。接下来，我们使用针对ATG2A和RAB1B的siRNAs来研究它们的影响。结果表明，siATG2A和siRAB1B抑制增殖、集落形成、迁移和侵袭（图5C-I）。此外，siATG2A和siRAB1B降低了LC3 II的水平，增加了P62在HCC细胞中的表达（图5 J）和阻止自噬小体合成（图5 K，L）。基于这些结果，我们认为ATG2A和RAB1B是HCC自噬的癌基因和阳性调节因子。

6.miR-541通过下调ATG2A和RAB1B来抑制HCC中自噬的进展
   通过共转染miR-541抑制剂和siATG2A或siRAB1B进行了一系列拯救试验，以进一步研究miR-541介导的HCC抑制的分子机制。 在转染siATA2A和siRAB1B的细胞中，miR-541抑制剂对增加HCC细胞增殖，迁移和侵袭的作用显著降低（图6A-F）。 siATG2A和siRAB1B逆转了miR-541抑制剂促进自噬的作用（图6G，H）。 总体而言，ATG2A和RAB1B的下调至少部分有助于miR-541对HCC细胞的功能作用。

7.miR-541增强索拉非尼诱导的肝癌细胞体内外死亡
   考虑到自噬在加重索拉非尼耐药中的关键作用，我们随后研究了miR-541对HCC细胞对索拉非尼敏感性的影响。我们初步探讨了miR-541表达对HCC患者对索拉非尼反应的显著影响。对miR-541低表达或高表达的患者进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示miR-541高表达的HCC患者可从索拉非尼治疗中获益，而miR-541低表达的患者则不能获益（图7A）。此外转染了miR-541模拟物的HCC细胞对索拉非尼的敏感性高于对照组细胞，其表现为50%的抑制浓度（IC50）降低，而转染了miR-541抑制剂的细胞对索拉非尼的耐受性高于对照组细胞，其表现为IC50的升高（图7B-E）。最后，我们评估Ad-miR-541治疗是否会加强索拉非尼对HCC的影响。裸鼠皮下移植HCC细胞，接受Ad-Max或Ad-miR- 541的瘤内注射，以及索拉非尼或vehicle DMSO的腹腔注射。Ad-miR- 541和索拉非尼均抑制肿瘤的生长、体积和重量（图7 F-H）。值得注意的是，Ad-miR-541和索拉非尼的联合使用产生了协同效应，与对照组相比，最大程度地抑制了肿瘤的生长。免疫组织化学染色显示，与Ad-Max和DMSO处理的肿瘤相比，Ad-miR-541治疗或索拉非尼治疗的肿瘤中Ki-67阳性肿瘤细胞数量减少，而Ad-miR-541和 索拉非尼联合使用进一步降低了Ki-67水平（图7I）。 此外，与对照组相比，用Ad-miR-541或Ad-miR-541和索拉非尼的联合治疗可导致ATG2A和RAB1B的表达明显降低，而与对照组（Ad-Max +DMSO）相比，索拉非尼治疗可可显著提高ATG2A和RAB1B的表达。 总而言之，miR-541增强了索拉非尼对HCC生长的抑制作用，这至少部分归因于其对ATG2A和RAB1B表达的调节作用。

结论：
   本研究强调了miR-541在HCC中的生物学意义，阐明了一个以前未被认识的HCC进展的分子机制。这些发现为HCC的个体化治疗提供了三个新的治疗靶点和预后标志物。推进基于miR-541的术后检测和治疗干预的转译研究将使HCC患者受益。