基金又一新方向———细胞焦亡的抑制
细胞焦亡（pyroptosis）是一种新发现的细胞程序性死亡方式，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体重要天然免疫反应，在拮抗感染和内源危险信号中发挥重要作用。相比于细胞凋亡（apoptosis），细胞焦亡发生的更快，并会伴随大量促炎症因子的释放。2020年 03 月20日， Muendlein HI, Jetton D, Connolly WM, 等人，在Science上发表了一篇关于cFLIP抑制细胞焦亡的机制文章“cFLIP protects macrophages from LPS-induced pyroptosis via inhibition of complex II formation”。
细胞死亡和炎症是宿主对感染的相互依赖的反应。 在焦细胞凋亡期间，白细胞介素1b（IL-1b）的释放通过caspase-1和caspase-11介导的Gasdermin D孔形成。 在体内，对脂多糖（LPS）的反应导致IL-1b分泌。 然而，在体外，鼠巨噬细胞需要炎性体驱动的IL-1b成熟的第二个“危险信号”。 最近的报道显示，在LPS活化的巨噬细胞中caspase-8介导的细胞凋亡，但在这些条件下有关IL-1b释放的证据相互矛盾。 在这里，为了进一步表征LPS诱导的体外分泌机制，作者揭示了细胞FLICE样抑制蛋白（cFLIP）在调节炎症反应中的重要作用。
1.TAK1抑制之前的LPS启动
LPS驱动的死亡需要CASP8和GSDMD，但不需要NLRP3，CASP1或CASP11。 这表明cFLIP L缺乏症在LPS激活后严格促进焦磷酸化。 cFLIP L KD消除了抑制TAK1诱导发烧的要求。 cFLIP L的沉默概括了TAK1抑制作用（通过YopJ或5z7处理），暗示cFLIP L是响应LPS的主要细胞凋亡调节因子之一。
图1. TAK1抑制之前的LPS启动引发IL-1b释放，抑制细胞死亡并调节cFLIP水平。
（A）BMDM中B6，无RIP1激酶失活（RIP1Ki），Trif-/-，Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-的小鼠在LPS / 5z7处理下的细胞死亡。 （B）在指定治疗后6小时，IL-1b从B6 BMDM中释放。 LPS预灌注（10或100 ng / ml）分别在添加5z7或尼日灵之前4小时进行。 （C）与LPS / 5z7或LPS-pre-primed / 5z7同时刺激的B6 BMDM中的细胞死亡。 （D）在B6 BMDM中，LPS，LPS / 5z7或LPS预涂底漆/ 5z7处理1小时后，相对于Cflar mRNA水平标准化为Gapdh（磷酸甘油醛磷酸脱氢酶）。 R.U.，相对单位。 （E）cFLIP，GSMDD的全长（FL）和裂解产物，以及从LPS / 5z7或LPS–预处理的B6 BMDM的全细胞裂解液（WCL）或从上清液（Sup。）沉淀的胱天蛋白酶。 （F）B6 BMDM中的cFLIP蛋白水平被cFLIP L或cFLIP R击倒或用非靶向（NT）对照转导。（G）B6 BMDM中被cFLIP L或cFLIP R击倒并被刺激的细胞死亡[在（F）中显示的敲低程度]。来自细胞死亡测定和免疫印迹的数据代表了三个或更多独立实验，并且细胞死亡数据表示为一式三份孔的平均值±SD。 IL-1b释放数据表示为来自三个或更多独立实验的一式三份孔的平均值±SD。使用方差分析（ANOVA）用于组间比较。
2.cFLIP L是响应LPS的细胞凋亡的主要调节剂之一
细胞死亡需要受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIP1）和GSMDD的激酶活性，但伴随着低的IL-1b水平，这可能是由于抑制了MAPK和NF-kB介导的前IL- 1b生产。与同时用LPS和5z7处理的细胞相比，在5z7处理之前用LPS预灌注的骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）产生的IL-1b水平明显更高。
图2. LPS在不存在cFLIP L的情况下诱导caspase-8介导的细胞凋亡。
（A）B6，Trif-/-和RIP1Ki BMDM中的细胞死亡被cFLIP L击倒并受到刺激。 （B）用LPS或LPS / 5z7刺激长达1小时30分钟的B6和B6 cFLIP L -KD BMDM中PI掺入和膜联蛋白V染色的动力学20倍放大成像。比例尺：100 mm。 （C）从半纤维素裂解物（WCL）或从B6NT对照或B6cFLIP L -/-BMDMs的上清液中沉淀的所示半胱氨酸蛋白酶的全长和裂解产物。 （D）在LPS / 5z7刺激的B6巨噬细胞或LPS处理的cFLIP L -KD BMDM中用CASP3 / 7抑制剂抑制细胞死亡。 （E）用LPS或LPS / 5z7刺激的B6，Nlrp3-/-和Casp1-/-Casp11-/-巨噬细胞中的细胞死亡。 （F）B6，Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-BMDM中的细胞死亡被击倒并被刺激（如图S3I所示的KD），刺激了cFLIPL。 （G）从B6NT控制器B6cFLIP L -KDBMDM刺激的全长和切割GSDMD所示。 在WT或YopJ缺陷型（DyopJ）Y。假性结核病刺激下的B6NT和B6cFLIP L -KD BMDM中，CASP8和GSDMD的细胞死亡和（I）裂解（图S3L所示的KD的程度）。未感染，未感染。所有的免疫印迹和细胞死亡数据代表三个或更多独立实验。细胞死亡数据表示为一式三份孔的平均值±SD。
3.cFLIP L缺失促进LPS响应
cFLIP L不足足以驱动对LPS的复合物II的形成。 LPS / 5z7也推动了复合物II的形成，并且在早期时间点在复合物中检测到了cFLIPL。 LFL诱导的cFLIP L -KD细胞中复合物II的形成依赖于TRIF和RIP1激酶活性。 在cFLIP L -KD细胞中，复杂II的形成和LPS诱导的细胞死亡都需要进行修饰。 因此，cFLIP L和RIP1的激酶活性调节TRIF信号下游的复合物II的形成，并决定细胞死亡的程度和方式。
图3. cFLIP L缺乏促进LPS响应，在TRIF下游形成复合物II。
（A）B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L击倒或用NT对照转导。 （B）按指示刺激的B6 NT和B6 cFLIP L -KD BMDM中的FADD免疫沉淀（IP），并探测复合物II成分。（A）中显示的敲低程度（C）B6和Trif-/-BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L击倒或NT对照转导。（D）B6和Trif-/-BMDM中的FADD IP被敲除cFLIP L，如所示被刺激，并探测复杂的II成分[（C）所示的敲低程度]。 （E）B6和RIP1Ki BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L击倒或用NT对照转导。 （F）B6和Trif-/-BMDM中的FADD IP击倒cFLIP L，如所示进行刺激，并检测复杂的II成分[（E）中所示的敲低程度]。 （G）B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平降低了cFLIP L或用NT控件进行转导。 （H）如所示刺激2小时的B6 NT和B6 cFLIP L -KD中的FADD IP，并检测复合物II成分[（G）中显示的敲低程度）。 （I）B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L击倒或用NT对照转导。 （J）LPS和LPS / 5z7刺激的cFLIP L沉默或NT对照B6和RIP1Ki BMDM中的总和pRIP1（S166）水平[（I）中显示的敲低程度]。所有的免疫印迹代表三个或更多独立实验。
4.cFLIP L缺失，LPS激活的巨噬细胞迅速分泌IL-1b
当cFLIP L水平低时，CASP8同型二聚体容易形成。完全活跃的CASP8裂解并激活远处的靶标，LPS激活的巨噬细胞迅速经历热解并分泌IL-1b。在不存在cFLIP L的情况下，CASP3，CASP7和CASP9对于CASP8驱动的细胞凋亡是必不可少的。相反，CASP8可能直接激活GSDMD来驱动细胞凋亡，而NLRP3炎症小体来驱动IL-1b成熟和释放。
图4. cFLIP L缺乏会驱动IL-1b成熟并响应来自LPS的单个信号而释放。
（A到C）IL-1b从（A）B6 NT对照，B6 cFLIP L -/-和B6 cFLIP R -/-BMDM释放; （B）为cFLIP L敲低的RIP1Ki和Trif-/-BMDM; （C）经过指定治疗6小时后，RIP3 / CASP8和GSDMD缺陷型BMDM敲低cFLIP L。（D）用LPS刺激4小时，或用LPS尼日利亚霉素刺激2小时的B6 NT对照和B6 cFLIP L-/- BMDM中的ASC斑点的代表性60X图像（图S4D中显示的敲低程度）。比例尺：30毫米。在针对cFLIP L的B6，Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-BMDM中ASC +细胞的百分比。 （F） IL-1b在b6，Nlrp3-/-和Casp1-/-Casp11-/-巨噬细胞中释放，对于cFLIP L沉默并如所指示的被刺激。（G）B6 BMDM对cFLIP L沉默并用WT或缺乏YopJ的（DyopJ）假结核耶尔森氏菌6小时。 （H）由cFLIP L调节的LPS驱动的细胞凋亡和IL-1b产生的模型。 IL-1b释放和ASC百分比数据表示为来自三个或更多独立实验的一式三份孔的平均值±SD。方差分析（ANOVA）用于比较各组。
结 论：
长异构体cFLIP L的缺乏会促进复合体II的形成，从而引起焦磷酸化，并且它们仅响应LPS就能分泌IL-1b。