新机制—CAF外泌体调节胃癌细胞铁死亡

    铁死亡是一种新的非凋亡性细胞死亡方式，由铁依赖性的脂质过氧化物的积累引起。肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）通过分泌多种生物活性物质支持肿瘤的进展和耐药性。然而，CAFs在调节肿瘤细胞脂质代谢和铁死亡中的作用仍然是未知的。接下来，小编为大家讲解发表于“Molecular Cancer”上的文章“CAF secreted miR-522 suppressesferroptosis and promotes acquired chemo-resistance in gastric cancer”。

    在本研究中，我们应用质谱技术筛选胃癌中铁死亡相关基因，超离心法分离外泌体，RT-qPCR法检测CAF分泌的miRNAs。以Erastin诱导铁死亡，通过测定脂质ROS、细胞活力和线粒体膜电位来评价铁死亡程度。
结 果：
1）GC中与铁死亡相关的关键基因的筛选
    我们首先用质谱法比较了GC特异性蛋白，发现GC肿瘤组织（T）中的一组蛋白表达明显低于癌旁组织（P）。ALOX15是导致铁死亡的关键基因之一，呈急剧下降趋势，而肿瘤组织中USP7和hnRNPA1的水平明显升高（图1a）。随后，测定ALOX15蛋白和mRNA。ALXO15蛋白总体呈下降趋势，但ALOX15mRNA无明显变化（图1b-d）。我们还通过IHC检测了ALOX15的分布，ALOX15主要在癌旁组织的腺体细胞中表达，少量在腺瘤细胞中表达（图1e）。根据ALOX15蛋白水平的平均值，将GC患者分为ALOX15高组和ALOX15低组。高水平的ALOX15蛋白与胃癌患者的总生存率（OS）有更好的相关性（图1f）。脂质ROS是ALOX15产生的一种重要代谢物。在肿瘤组织中脂质ROS的水平明显降低（图1g），并且与ALOX15呈正相关（图1h）。这些数据表明，ALOX15在调节胃肿瘤脂质活性氧生成中起着关键作用。

2）外泌体miR-522主要来源于肿瘤微环境中的CAFs
    虽然我们已经证明miR-522在GC中明显上调，但是miR-522的起源仍然不清楚。分离癌组织中CAFs和癌旁正常成纤维细胞（NFs），检测原代细胞和外泌体miR-522水平。与NFs相比，CAFs中CAFs、α-SMA、FAP和FSP1的标记物均明显增加（图2a和b）。与肿瘤细胞和NFs相比，CAFs中miR-522的浓度最高（图2c）。NFs、TCs和CAFs的外泌体按上述方法分离并拍摄（图2d），外泌体的标记物通过WB分析检测（图2e）。miR-522在CAF外泌体中的含量最高，其次是TC外泌体（图2f）。正如预期的那样，来自CAFs的外泌体miR-522也与ALOX15和脂质ROS呈负相关（图2g和h）。这些数据表明，GC肿瘤微环境中的exo-miR-522主要由CAFs分泌。

3）CAFs分泌的exo-miR-522抑制GC细胞的铁死亡
    为探讨CAFs来源的exo-miR-522对胃癌细胞铁死亡的调节作用，分离CAF外泌体并与人胃癌细胞株共培养。SGC7901细胞、MGC803细胞和MKN45细胞分泌的外泌体照片如图3a所示，这些外泌体还含有CD63、TSG101和Alix（图3b）。CAFs中miR-522的含量是GC细胞株的6倍，在外泌体中也有同样的趋势（图3c）。CAF外泌体与GC细胞共培养，6h时在SGC7901细胞和MKN45细胞中均检测到PKH-26 标记的CAF外泌体（图3d），表明CAFs来源的外泌体能与GC细胞有效融合。CAFs外泌体显著抑制了GC细胞中ALOX15的表达（图3e-g）。此外，exo-miR-522被证明能有效抑制erastin诱导的GC细胞脂质ROS积聚和铁死亡（图3h，3i）。erastin处理的SGC7901细胞线粒体膜电位明显升高（图3j），CAF外泌体部分逆转了erastin对线粒体的损伤（图3k）。总之，CAFs分泌的外泌体miR-522抑制ALOX15的表达，下调GC细胞的铁死亡水平。

4）USP7通过稳定hnRNPA1促进miR-522的分泌
    在目前的研究中，hnRNPA1在胃肿瘤组织中上调。IHC分析显示了USP7、HNNPA1和ALOX15之间的相关性（图4a）。接下来，我们检测发现上述12种肿瘤组织的hnRNPA1和USP7在CAFs中高表达（图4b-d）。此外，hnRNPA1和USP7水平与外泌体miR-522呈正相关（图4e，4f），提示USP7和hnRNPA1参与CAFs miR-522分泌。此外，与去泛素相关的USP7在增加HRNPA1水平方面起着重要作用（图4g）。
    为了进一步研究USP7、hnRNPA1和miR-522之间的内在联系，我们构建了包含hnRNPA1和USP7编码序列的质粒以及两个基因的siRNAs。质粒的转染显著上调了hnRNPA1和USP7的表达，而siRNAs的应用导致了这两个基因的显著减少（图4h，4i）。在CAFs中，hnRNPA1或USP7的过表达促进外泌体miR-522的表达；然而，这两个基因的敲除相对降低了外泌体miR-522的水平（图4j）。拯救实验表明，过表达的hnRNPA1或USP7部分中和了各自siRNAs对exo-miR-522的影响（图4h-j）。接下来，在免疫沉淀法的产物中，可以使用抗hnRNPA1抗体检测USP7，反之亦然（图4k）。此外，USP7与HRNA1泛素化水平之间呈负相关（图4l）。总之，这些结果表明USP7通过去泛素化稳定了CAFs中的hnRNPA1，从而增强了外泌体miR-522的分泌。

5）hnRNPA1直接介导CAF中外泌体miR-522
    为了进一步验证hnRNPA1选择性地将miR-522包装成外泌体中的作用，我们利用RBPDB预测了miR522结合蛋白的表达。图5a显示了前三个RNA结合蛋白，hnRNPA1得分最高。我们设计了PABPC1和ACO1 siRNAs，PABPC1和ACO1明显被siRNAs敲除（图5b）。这些siRNAs的转染对CAFs中miR-522的表达几乎没有影响（图5c），但是hnRNPA1的下调显著降低了CAF外泌体miR-522的水平（图5d）。用生物素标记野生型和突变miR-522，转染CAFs。结果表明，在使用野生型生物素miR-522产生co-IP时，只检测到hnRNPA1（图5e）。另外，Cy3标记的miR522被转染到CAFs中，来自CAFs的外泌体通过细胞膜与较低的GC细胞融合。Cys-miR-522在SGC7901细胞和MKN45细胞中均能清楚地被检测到，并且在CAFs中hnRNPA1的沉默阻止了Cys-miR-522从CAFs向GC细胞的转移（图5h-k）。这些数据表明hnRNPA1在miR-522进入CAF外泌体的过程中起着重要的中介作用。

6）化学毒性通过激活USP7/hnRNPA1途径促进CAFs分泌miR-522
    为了获得CAFs化疗诱导的损伤反应，我们检测了用亚致死剂量顺铂或紫杉醇治疗的GC细胞。顺铂和紫杉醇对CAFs细胞活力的抑制作用如图6a，6b所示。选用8μg/mL顺铂和100 nmol/L紫杉醇作为CAFs的亚致死剂量。结果表明，顺铂或紫杉醇均能促进CAFs中USP7和hnRNPA1的表达（图6c和d）；化疗毒性也增强了hnRNPA1的去泛素化（图6e和f），从而导致miR-522在外泌体中的表达上调，而对原发性CAFs中miR-522的表达无明显影响（图6g）。这一结果表明，化疗通过增加USP7的表达和减少hnRNPA1的泛素化，促进外泌体miR-522分泌。
    从经顺铂或紫杉醇处理的CAF中分离的外泌体与GC细胞共培养结果看，它们显示出比对照CAF外泌体更大的抑制ALOX15蛋白表达的能力，而不影响ALOX15转录（图6h-j）。在SGC7901和MKN45细胞中，顺铂处理的CAF外泌体和紫杉醇处理的CAF外泌体均能更有效地减少脂质ROS的产生并抑制erastin诱导的铁死亡（图6k，6l）。在培养基中加入顺铂可导致GC细胞的高死亡率，而顺铂处理的CAF外泌体和紫杉醇处理的CAF外泌体可降低GC细胞的死亡率（图6m）。这些体外实验为CAF外泌体在化疗过程中降低药物敏感性提供了证据。

7）USP7/hnRNPA1/miR-522对胃癌生长及化疗敏感性的体内调节作用
    在体内评价USP7/hnRNPA1/miR-522轴对肿瘤生长和化疗疗效的影响。我们用含有shRNAs的慢病毒分别产生了三株敲除USP7、hnRNPA1和miR-522的胃成纤维细胞株，并将这些成纤维细胞株与SGC7901细胞混合用于小鼠皮下肿瘤移植（图7a）。从第10天开始，每5天给这些荷瘤小鼠注射顺铂或生理盐水，第30天取出肿瘤。CAFs中USP7、hnRNPA1或miR-522的敲除明显抑制肿瘤生长，增强对顺铂的敏感性（图7b-d），但肿瘤中脂质ROS水平上调（图7e）。另外，USP7的敲除降低了hnRNPA1蛋白水平；CAF中三个基因的抑制导致癌细胞中ALOX15的上调（图7f-h）。此外，顺铂的治疗相对促进了CAFs中USP7/hnRNPA1和癌细胞中ALOX15的表达（图7f-h），但ALOX15的mRNA变化不大（图7i）。从这些小鼠中分离出血浆外泌体（图7j），外泌体miR-522在USP7-KD和hnRNPA1-KD组中水平急剧下降，在miR-522-KD组中最低（图7k）。细胞凋亡标志物CASP3在CAFs中随USP7、hnRNPA1和miR-522基因敲除而略有升高（图7l-m）。综上所述，这些结果表明USP7/hnRNPA1促进CAFs分泌exo-miR-522，降低肿瘤中脂质ROS水平，促进肿瘤生长。此外，通过阻断miR-522的分泌，可以提高化疗药物的疗效。

8）USP7/hnRNPA1/exo-miR-522通路对肿瘤移植小鼠生存的影响
    USP7、hnRNPA1和miR522的抑制延长了荷瘤小鼠的生存期（图8a），而顺铂组小鼠的存活率高于生理盐水组（图8b）。最后，我们提供了一个示意图来说明跨细胞信号通路在调控GC细胞铁依赖性中的生物学作用，包括USP7、HRNPA1、exo-miR-522和ALOX15（图8c）。

结 论：
    CAFs通过靶向ALOX15和阻断脂质ROS的积累，分泌外泌体miR-522抑制癌细胞的铁死亡。由USP7、hnRNPA1、exo-miR-522和ALOX15组成的细胞间通路揭示了GC中获得性耐药的新机制。