禁食与结直肠癌发展

    有证据表明，禁食对包括结直肠癌在内的多种癌症都有广泛的抗肿瘤作用。然而，禁食参与结直肠癌进展的机制尚不清楚。因此，小编为大家带来发表于“NATURE COMMUNICATIONS”上的文章“Fasting inhibits aerobic glycolysis and proliferation in colorectal cancer via the Fdft1-mediated AKT/mTOR/HIF1α pathway suppression”，给大家详细介绍禁食参与结直肠癌的机制。

    在本文中，我们发现，在抑制结直肠癌细胞有氧糖酵解和增殖的过程中，禁食会上调FDFT1的表达。FDFT1的下调与结直肠癌的恶性进展和预后不良有关。此外，FDFT1在结直肠癌中起着重要的抑癌作用。在机制上，FDFT1通过负调控AKT/mTOR/HIF1α信号来发挥抑瘤作用。
结 果：
1.禁食损害糖酵解和抑制结直肠癌增殖
    为了探讨禁食对结直肠癌细胞增殖的影响，我们采用CCK8和EdU检测细胞增殖。发现禁食显著抑制CRC细胞增殖（图1a，b，d）。接着，为了评估禁食对大肠癌增殖的影响，我们进行了蛋白质组学技术和生物信息学分析（图1c）。“糖酵解/糖异生”途径受到高度下调（图1c）。为了验证禁食对葡萄糖代谢的影响，我们检测了葡萄糖摄取量和乳酸生成量。结果表明禁食降低了细胞中葡萄糖的摄取和乳酸的产生（图1e，f）。细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）在禁食模拟培养基中培养的细胞中降低（图1h，1i）。此外，在禁食模拟培养基中培养的CT26和SW620细胞中，葡萄糖代谢中限速酶的转录和表达下调（图1g，k）。这些数据表明，禁食在抑制结直肠癌细胞糖酵解方面起着至关重要的作用。
    为了进一步验证禁食对体外葡萄糖代谢的影响，我们将CT26细胞皮下注射到BALB/c小鼠体内。结果表明，禁食明显减弱了小鼠的肿瘤生长（图1j，l，m，o）。此外，我们使用18F-FDG microPET/CT成像系统来评估空腹在葡萄糖代谢中的作用。禁食显著抑制体内异种移植模型中18F-FDG的摄取（图1n，p）。综上所述，禁食损害糖酵解和抑制结直肠癌增殖。

2.FDFT1在CRC中因禁食上调并与预后相关
    首先，我们证实禁食可以上调FDFT1的表达。在GSE60653数据集中，与对照组相比，禁食组中FDFT1的表达显著增加（图2a）。此外，在iTRAQ蛋白质组学分析中，与对照组相比，禁食组FDFT1的相对表达显著升高（图2b）。qRT-PCR结果表明，禁食组FDFT1的mRNA表达明显增加（图2c），WB显示禁食模拟培养基提高了细胞内FDFT1的蛋白水平（图2d，e）。因此，我们的结果表明，禁食可以上调结直肠癌中FDFT1的表达。接着，我们采用IHC和qRT-PCR方法，比较了FDFT1在人结直肠癌组织和癌旁组织中的表达。FDFT1在大多数肿瘤组织中表达下调（图2f，g）。另外，结直肠癌组织中的FDFT1水平明显低于非癌组织（图2h）。因此，FDFT1在结直肠癌组织中下调。
    为了确定FDFT1在结直肠癌中的作用，我们评估了结直肠癌患者FDFT1表达与临床病理特征之间的关系。FDFT1的低表达与肿瘤大小、组织学类型、淋巴结转移、肿瘤分化、浸润、远处转移及临床分 期密切相关。Kaplan-Meier分析显示，高表达的FDFT1预测结直肠癌患者的预后更好（图2i）。
    最后，为了验证FDFT1在CRC中的作用，我们使用GEO和GEPIA数据库来分析TCGA数据集。在GDS2609和GDS4382数据集中，结直肠癌组织中FDFT1基因的表达明显低于正常组织（图2j、k）。此外，GEPIA数据库在结直肠癌患者中，低FDFT1与高TNM分期相关（图2l）。TCGA数据集的生存分析表明，FDFT1的高表达与较好的预后相关（图2m）。总之，这些结果表明FDFT1在结直肠癌组织中表达下调，并与结直肠癌的恶性进展和预后不良相关。

3.FDFT1对结直肠癌细胞增殖的负调控作用
    为了评估FDFT1在结直肠癌中的生物学功能，在CT26和SW620细胞中进行了慢病毒介导的FDFT1过表达和敲除。如qPCR和WB结果所示，在CT26和SW620细胞中，FDFT1过表达（图3a，b）和敲除（图3c，d）的效率是有效的。CCK8、EdU和集落形成试验表明，FDFT1过表达抑制CRC细胞增殖，而FDFT1基因敲除促进CRC细胞增殖（图3e-n）为了进一步研究FDFT1对细胞侵袭的影响，我们进行了transwell实验。FDFT1过表达抑制了细胞侵袭（图3o，p），而FDFT1基因敲除增加了细胞侵袭（图3q，r）。总之，FDFT1的过表达抑制了结直肠癌细胞的增殖和侵袭。

4.FDFT1是CRC患者禁食的重要下游靶点
    我们评估禁食对结直肠癌的抑制作用是否随着FDFT1的过表达而增强。我们的数据表明，与单独治疗相比，FDFT1过表达联合禁食对CRC细胞增殖的抑制作用最大（图4a）。此外，WB结果表明，禁食和FDFT1的过表达增加了结直肠癌细胞中FDFT1的蛋白水平。在抑制结直肠癌细胞增殖中，禁食对过表达FDFT1的细胞中FDFT1的表达水平产生了相加效应（图4b）。接着，为了证实FDFT1过表达与禁食联合应用对体外观察到的细胞增殖的影响，我们将CT26细胞和FDFT1高表达的CT26细胞皮下注射BALB/c小鼠。我们的结果表明，FMD和FDFT1的过表达都抑制了小鼠的肿瘤生长。与单用FMD或单用FDFT1高表达相比，FMD联合FDFT1高表达对小鼠肿瘤生长的抑制作用最为显著（图4c，d）。与这些结果一致，在异种移植模型中，FMD联合FDFT1过表达对18F-FDG摄取具有最显著的抑制作用（图4e，f）。此外，IHC结果表明，FMD或FDFT1的过表达均能提高体内FDFT1的蛋白水平。（图4g，h）。最后，为了证实我们的体外观察，我们在BALB/c小鼠皮下注射CT26细胞和FDFT1基因敲除CT26细胞。当FMD联合FDFT1敲除CT26细胞植入体内时，禁食对CRC肿瘤生长的抑制作用被逆转（图4j，k）。总之，这些结果表明FDFT1是禁食的一个重要下游靶点， 它介导了CRC细胞增殖的抑制。

5.在CRC中mTOR水平与FDFT1水平呈负相关
    为了确定FDFT1抑制结直肠癌细胞增殖的信号通路，我们再次进行了蛋白组学和生物信息学分析。我们推测FDFT1抑制了mTOR相关通路，从而抑制了结直肠癌细胞的糖酵解。我们发现FDFT1的表达与mTOR的表达呈负相关（图5a，5b）。接着，我们评估了mTOR沉默对FDFT1表达水平的影响，以及用mTOR抑制剂治疗是否会逆转FDFT1基因敲除的影响。我们发现mTOR沉默增加了CT26细胞中FDFT1的表达水平。mTOR抑制剂可防止FDFT1基因敲除细胞中mTOR蛋白水平的升高（图5c-f）。此外，我们通过CCK8检测mTOR对结直肠癌细胞增殖的影响，发现mTOR的沉默降低了细胞增殖（图5g，h）。这表明mTOR是结直肠癌细胞增殖的一个阳性调节因子。其次，我们评估mTOR对结直肠癌细胞糖酵解的影响。沉默mTOR可降低CRC细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成以及糖酵解相关蛋白的表达（图5i-o）。最后，我们分析了TCGA数据集中mTOR表达与相关糖酵解基因编码的蛋白表达的相关性。mTOR的表达与它们的表达有很强的相关性（图5p-t）。因此，这些观察结果支持了mTOR对CRC细胞增殖中有氧糖酵解的积极调节的假设。

6.FDFT1通过抑制CRC中AKT-mTOR-HIF1通路来抑制糖酵解
    我们的结果表明FDFT1在CT26和SW620细胞中是葡萄糖代谢的负调控因子（图6a-j）。此外，我们发现过表达FDFT1降低了CRC细胞中AKT、mTOR和HIF1细胞的蛋白和mRNA的表达(图6k，n)。相反，FDFT1基因敲除增加了AKT、mTOR和HIF1细胞的蛋白和mRNA表达（图6l，n）。这些结果表明，FDFT1通过抑制CRC中的AKT-mTOR- HIF1α途径来抑制糖代谢。

7.禁食与mTOR抑制剂协同抑制CRC增殖及FDFT1/AKT-mTOR-HIF1α通路在CRC患者中的临床意义
    我们探讨了雷帕霉素是否能与FMD协同抑制结直肠癌的增殖。结果表明，FMD和1 mg/kg剂量的雷帕霉素均能强烈抑制CRC的增殖，显著提高生存率（图7a-c）。此外，我们发现雷帕霉素治疗可以增加FDFT1蛋白和mRNA的表达水平（图7d，e）。我们还发现禁食和雷帕霉素在延缓结直肠癌进展、提高生存率和上调FDFT1方面有协同作用（图7a-e）。接着，我们分析了TCGA数据集，发现 FDFT1高表达和AKT1、mTOR、HIF1α、GLUT1和HK2低表达的患者比FDFT1低表达、AKT-mTOR-HIF1α途径和糖酵解基因高表达的患者存活时间更长（图7f-j）。

结 论：
    禁食通过FDFT1/AKT-mTOR-HIF1α轴对结直肠癌细胞葡萄糖代谢和增殖具有负调节作用。基于mTOR抑制的治疗可能是一种有前途的治疗CRC的方法。