肾细胞癌中常规思路的10分文章详览

    肾细胞癌（RCC）是泌尿外科中导致患者死亡的第二大肿瘤，仅在2018年就有约403426个新增病例。但是其治疗始终没有非常乐观的进展。circRNA在许多疾病中被证实具有调控作用，并可作为治疗靶标，但是在RCC中的作用尚不清楚。本文旨在探究RCC中是否存在某个关键circRNA参与调控了RCC的恶性进展，并于今年6月5日新近发表在《Molecular Cancer》（IF:10.679）期刊上。
结 果：
1、CircTLK1在RCC组织中过表达并于其不良预后有关
    通过肾上皮细胞和RCC细胞测序获得差异表达序列，Fig. 1a是最显著差异的10个circRNA。CircTLK1不仅在RCC细胞系和RCC组织中高表达，在术后转移中RCC病人中也高表达，并预示着不良预后（Fig. 1b-f）。CircTLK1长247nt，包含两个外显子，不可被RNase R消化（Fig. 1g-i）。

图1 CircTLK1在RCC组织中过表达并于其不良预后有关

2、敲除circTLK1抑制RCC细胞增殖
    shRNA-2可显著抑制三种细胞系中circTLK1的表达，但对TLK1的表达没有影响（Fig.a-c）。此外，使用shRNA-2干扰掉circTLK1的表达后RCC细胞的增殖能力显著下降。

图2敲除circTLK1抑制RCC细胞增殖

3、敲除circTLK1抑制RCC细胞迁移和侵袭

    如图3a-c所示，shRNA-2干扰circTLK1的表达后RCC细胞的迁移和侵袭能力显著下降。鉴于这种影响，作者进一步检测了上皮间质转化相关分子的表达，结果表明在circTLK1沉默的细胞中，间质标记物N-cadherin和vimentin表达明显下降，而上皮标记物E-cadherin表达在circTLK1抑制的细胞中升高（图3e）。

图3敲除circTLK1抑制RCC细胞迁移和侵袭

4、circTLK1作为miR-136-5p海绵

    为分析circTLK1的分子途径，使用FISH和核质分离实验来检测circTL1K的亚细胞定位，结果显示主要分布在细胞质（Fig.4a-b），这暗示着circTLK1可能通过捕获miRNA释放其靶基因转录本发挥功能。在线预测获得5个可与circTL1K结合的miRNA，然后生物素circTL1K探针在RCC细胞中显著下拉circTLK1，而miR-136-5p是惟一被生物素circTL1K探针下拉的miRNA（Fig.4c-d）。之后荧光素酶实验进一步证实两者间的作用关系（Fig.4e-f）。然而，过表达或敲除circTL1K对RCC细胞中miR-136-5p的表达没有影响（Fig.4i-j）。这些表明circTLK1对miR-136-5p起海绵吸附作用。

图4 circTLK1作为miR-136-5p海绵

5、miR-136-5p通过靶向CBX4促进RCC进展

    在线预测miR-136-5p的靶基因有CBX4，GNAS，LUZP6，MSL2，MTMR4和SOCS7（Fig 5a），并进一步通过综合转录分析发现miR-136-5p与CBX4的表达呈现负相关（Fig 5b）。荧光素酶实验显示共转染miR-136-5p与野生型CBX4质粒后荧光素酶活性显著升高，而转染突变型CBX4则没有变化（Fig 5c-d）。过表达miR-136-5p抑制了CBX4的mRNA和蛋白质水平（Fig 5e-g）。这些表明miR-136-5p直接靶向CBX4。此外，CBX4在RCC组织中上调表达，且与肿瘤大小和术后转移呈正相关（Fig 5i-j）。RCC病人中高表达CBX4具有较低的总体生存率（Fig 5k）。

图5 CBX4是miR-136-5p的直接靶点

6、CBX4敲除抑制细胞增殖，迁移和侵袭

    如图6所示，使用shRNA干扰CBX4表达后，ACHN 和769-P细胞系的增殖，集落形成，迁移和侵袭能力都显著下降。此外，CBX4的表达与VEGFA的表达呈正相关，shRNA干扰CBX4表达后VEGFA的表达显著抑制。

图6 CBX4敲除抑制细胞增殖，迁移和侵袭

7、过表达CBX4逆转了circTLK1对细胞增殖和转移的抑制作用

    为了探究circTLK1是否通过调控CBX4的表达改变肿瘤细胞的生物学功能，作者做了一个circTLK1和CBX4的拯救实验。如图7所示，敲除circTLK1明显抑制了CBX4的mRNA和蛋白质水平。CBX4过表达显著扭转了circTLK1诱导的肿瘤细胞的增殖抑制作用。在细胞的迁移，侵袭，集落形成实验中得出了一致的结果。上述表明circTLK1是通过调控CBX4的表达改变肿瘤细胞的生物学功能。

图7过表达CBX4逆转了circTLK1对细胞增殖和转移的抑制作用

8、circTLK1敲低可抑制体内RCC细胞的生长和转移

    为了探究在体内circTLK1对RCC肿瘤生长和肺转移的作用，构建了稳定的转染了shcircTLK1的769-P细胞并注射到裸鼠中从而构建裸鼠肿瘤移植及肺转移模型。在肿瘤异种移植模型中，与shNC相比，shcircTLK1的小鼠肿瘤明显更小，肿瘤的体积和和肿瘤也都显著下降（Fig. 8a-c）。此外，shcircTLK1小鼠体内的Ki67，CBX4和VEGFA的表达水平显著下降（Fig. 8d-e）。在肺转移裸鼠模型中，shcircTLK1小鼠的肺转移显著减少（Fig. 8f-h）。在肿瘤异种移植模型中，过表达CBX4逆转了shcircTLK1诱导的生长抑制（Fig. 8i-k）。这些体内实验结果表明circTLK1可能在促进RCC的体内生长和转移中发挥重要作用。

图8 circTLK1敲低可抑制体内RCC细胞的生长和转移

    总之，作者证明了circTLK1通过海绵吸附miR- 136-5p来调节CBX4的表达，从而促进了RCC的生长和转移(图8l)。

参考文献:

    Li Jianfa., Huang Chenchen., Zou Yifan., Ye Jing., Yu Jing., Gui Yaoting.(2020). CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol. Cancer, 19(1), 103. doi:10.1186/s12943-020-01225-2