新靶点！circRNA调控心肌肥厚

    心肌肥厚与正常心功能和受损心功能相关时可分为生理和病理两大类。众所周知，病理性心肌肥厚是心肌梗死、心律失常、心力衰竭甚至猝死的独立危险因素。了解心肌肥厚和向心力衰竭过渡的分子机制对于确定逆转适应性心脏重构甚至心力衰竭的新靶点至关重要。本文旨在探究circRNA在心肌肥厚中的调控作用及机制，本文于今年1月发表在Cardiovasc. Res杂志上。
结 果：
1、CircRNA_000203在Ang-II灌注的小鼠心肌中上调表达
    建立小鼠心肌肥厚动物模型，给予Ang-II灌注4周，体重/胫骨长度比值(HW/TL)显著增加(图1A)。WGA染色结果显示Ang-II灌注小鼠心肌细胞尺寸明显增大(图1B)。心肌肥厚小鼠中可观察到ANP和β-MHC蛋白表达显著增加 (图1 c)。RT-qPCR结果证实，在灌注ANG - II的小鼠心肌中，circRNA_000203及其亲本基因Myo9a mRNA的表达一致上调(图1D-E)。

图1 CircRNA_000203在Ang-II灌注的小鼠心肌中上调表达

2、CircRNA_000203在Ang-II诱导的NMVCs细胞中上调
    本文采用ANG - II诱导的NMVC肥大细胞模型。NMVCs细胞大小明显增加，Ang-II-treated NMVCs细胞中ANP和β-MHC表达显著升高 (图2 a、2 b)。同样，在ANG - II处理的NMV中，circRNA_000203、Myo9a、Anp和Myh7 mRNA也显著上调(图2C)。circRNA_000203，而不是Myo9a mRNA，对RNase R处理具有抗性(图2D)。此外，使用Dactinomycin  D抑制RNA转录，并测量了Dactinomycin  D处理后NMVCs不同时间点的circRNA_000203和Myo9a mRNA的水平。Dactinomycin  D处理后4、8、12 h, circRNA_000203的相对表达量明显高于Myo9a mRNA的表达量(图2E)。此外，FISH和RT-qPCR检测显示，环状RNA在NMV中主要分布于细胞质 (图2F, 2G)。

图2 CircRNA_000203在Ang-II诱导的NMVCs细胞中上调

3、CircRNA_000203增强了NMVCs肥厚
    本文利用重组circRNA_000203腺病毒rAd-circ203介导过表达circRNA_000203在NMV中的表达。在感染了rAd-circ203的NMVC中，细胞大小显著增加(图3A)。NMVCs中，circRNA_000203而非Myo9a mRNA水平显著升高，Anp和Myh7 mRNA水平显著升高(图3B)。一致,蛋白表达的ANP和β-MHC也显著增强执行表达式的NMVCs circRNA_000203(图3 c)。

图3 CircRNA_000203增强了NMVCs肥厚

4、过表达circRNA_000203可在体内加重ANG - II诱导的心肌肥厚
    在Tg-circ203小鼠心肌中，circRNA_000203而非Myo9a mRNA高表达(图4A)。在本文中，在小鼠体内建立了Ang-II灌注4周的肥厚动物模型。超声心动图显示ANG - II灌注的Tg-circ203小鼠心脏结构和功能的变化。加入ANG - II的Tg-circ203小鼠EF和FS显著降低(图4B)。此外，WGA染色结果显示，加入ANG - II的Tg-circ203小鼠心肌细胞的大小显著增加(图4C)。免疫印迹结果表明，ANP的表达和β-MHC也显著增强心肌的Ang-II-infused Tg-circ203老鼠(图4 d)。

图4过表达circRNA_000203可在体内加重ANG - II诱导的心肌肥厚

5、鉴定miR-26b-5p和miR-140-3p作为circRNA-000203的海绵靶点
    序列分析显示，在circRNA_000203中，miR-26b-5p有两个潜在的结合位点(nt 607 628和nt 702 723)(图5A)，而miR-140-3p有一个潜在的结合位点(nt 964 984)(图5B)。而miR-26b-5p或miR-140-3p与circRNA_000203的相互作用在相应的结合位点发生突变后其信号可以被消除(图5A, 5B)。过表达circRNA_000203的NMV中，miR-26b-5p和miR-140-3p水平显著降低(图5C)。RNA下拉和RT-qPCR试验的结果表明,circRNA_000203下拉的数量miR-26b-5p-mut明显低于miR-26b-5p(图5 d)，和circRNA_000203下拉miR-140-3p-mut也显著低于miR-140-3p(图5)。利用生物素标记的CircRNA_000203探针从NMVCs裂解液中有效分离出CircRNA_000203(图5F)。同时，使用circRNA_000203探针，可以特异性地拉低miR-26b-5p和miR-140-3p，而与miR-144-3p无关的miR-144-3p(图5F)。

图5鉴定miR-26b-5p和miR-140-3p作为circRNA-000203的海绵靶点

6、MiR-26b-5p和miR-140-3p负调控Gata4表达
    在线预测miR-26b-5p、miR-140-3p的靶基因，图6A-B显示miR-26b-5p、miR-140-3p在Gata4 mRNA的3 -UTRs内的结合位置，并由荧光素酶实验证实。与阴性对照相比，转染miR-26b-5p、-140-3p mimic后，NMV中Gata4的mRNA和蛋白表达显著降低 (图6C)。如预期，过表达circRNA_000203的NMVC中，Gata4的mRNA和蛋白表达显著升高 (图6D)。此外，我们还观察到加入ANG - II的Tg-circ203小鼠心肌的Gata4 mRNA和蛋白表达显著增加 (图6E)。

图6 MiR-26b-5p和miR-140-3p负调控Gata4表达

7、MiR-26b-5p和miR-140-3p可消除circRNA_000203在NMV中促肥大作用
    研究了miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA对ANG - II处理的NMVCs肥大的一致影响。FITC-Phalloidin染色显示，在经过ANG - II处理的NMVCs中，细胞大小显著增加，但分别转染miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA后，这种细胞大小增加的情况可以被逆转(图7A)。Ang-II-treated NMVCs中，ANP、β-MHC和GATA4的蛋白表达是显著增强，但miR-26b-5p、140-3p和GATA4 siRNA转染后其表达回降(图7B)。FITC-Phalloidin染色结果显示，过表达circRNA_000203的NMVCs细胞尺寸明显增加，但miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA可以降低细胞大小(图7C)。此外，circRNA_000203-modified NMVCs细胞中ANP的蛋白表达、β-MHC和GATA4表达是显著增加，但miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA 转染后其表达下调(图7 d)。

图7 MiR-26b-5p和miR-140-3p减轻circRNA_000203对NMV的促肥大作用

结 论：
    总之，研究表明，circRNA_000203在心肌肥厚中上调，在体内和体外均促进心肌肥厚生长。CircRNA_000203可海绵化miR-26b-5p、-140-3p，增加GATA4表达，促进心肌肥厚（图8）。

图8 图形摘要