CircTLK1通过miR-136-5p促进肾癌的增殖和转移

    越来越多的证据表明，circRNAs是潜在的生物标志物，是肿瘤发生发展的关键调控因子。然而，circRNAs在肾癌中的确切作用尚不清楚。因此，小编在这里介绍了发表于“molecular cancer”的文章“CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p”。

    在本研究中，我们通过对RCC细胞株的circRNA高通量测序，将circRNA-TLK1（circTLK1）鉴定为一个新的候选基因。通过qRT-PCR检测肾细胞癌组织和细胞中mRNA、circRNA和miRNA的表达水平。我们进行了功能缺失实验来检测circTLK1在体外和体内RCC细胞表型中的生物学作用。最后采用RNA-FISH、RNA下拉、双荧光素酶报告、western blot和免疫组化等方法研究了circTLK1功能的分子机制。
结 果：
1.circTLK1在肾癌组织中高表达，其表达与预后不良显著相关
    为了探讨circRNA在肾细胞癌中的表达，我们进行RNA测序。结果发现正常肾上皮细胞和肾细胞癌细胞之间存在7335个circRNA的差异表达，其中上调1919条，下调5416条（图1a）。circTLK1（hsa_circ_0004442）是所有候选基因中上调幅度最大的一个。因此，我们研究了circTLK1在肾癌细胞和正常肾上皮细胞中的表达。数据显示，在ACHN、786-O和769-P细胞中，circTLK1的表达明显高于在HK2和293T细胞中的表达（图1b）。CircTLK1不仅在肾癌组织中高表达（图1c），而且在肾癌术后转移患者中高表达（图1d）。此外，与低circTLK1表达相比，肾癌患者高circTLK1表达与较低的总生存率（图1e）和较低的无病生存率（图1f）呈负相关，提示circTLK1可能是一种预后肿瘤标志物。circTLK1来源于TLK1的第9外显子和第10外显子，形成247nt的循环转录本（图1g）。进一步的序列分析显示circTLK1长247nt，包含两个外显子。此外，我们发现TLK1的外显子发生了头到尾剪接（图1h）。检测circTLK1的稳定性，结果显示RNase R不能消化circTLK1，但经RNase R处理后TLK1的mRNA表达显著下降（图1i）。

2.circTLK1基因敲除抑制肾癌细胞增殖
    为了鉴定circTLK1在肾癌中的病理功能，我们合成了一种特异性靶向于circTLK1的shRNA质粒载体，发现该载体稳定抑制三种肾癌细胞系中circTLK1的表达（图2a）。在shRNAs中，shRNA-2的敲除效率最高。然而，抑制circTLK1并没有改变TLK1的mRNA（图2b）和蛋白质（图2c）的表达。然后我们研究了circTLK1对肾癌细胞增殖的影响。CCK-8检测显示circTLK1敲除减慢了RCC细胞的生长（图2d）。菌落形成分析表明，在circTLK1沉默后，菌落数量明显减少（图2e，f）。

3.circTLK1基因敲除抑制RCC细胞的迁移和侵袭
    我们进行transwell实验，观察circTLK1对RCC细胞迁移和侵袭的影响。我们的结果表明， circTLK1下调降低了RCC细胞的迁移能力（图3a-c）。此外，circTLK1敲除抑制RCC细胞侵袭（图4d）。基于circTLK1在肾癌细胞迁移和侵袭中的作用，我们推测circTLK1可能介导肾癌细胞的上皮-间质转化（EMT）过程。如图3e所示，间充质标记物N-cadherin和vimentin在circTLK1沉默的细胞中的表达显著降低，而上皮标记物E-cadherin在circTLK1抑制细胞中的表达增加。

4.circTLK1起到miR-136-5p海绵的作用
    为了阐明circTLK1的分子机制，我们进行了FISH和核质分离分析来检测circTL1K的亚细胞定位。如图4a，b所示，我们发现circTLK1主要位于细胞质中，这表明circTLK1可能作为ceRNA来捕获miRNAs，导致特定的靶向转录物的释放。为了研究这个假设，我们利用circRNA相互作用数据库预测circTLK1的潜在靶点，我们选择了5种可能结合的miRNA，包括miR-136-5p、miR-421、miR-659、miR660-5p和miR-944。然后，进行RNA pull down分析评估circTLK1是否能直接捕获这些候选miRNAs。当circTLK1过表达时，生物素化的circTLK1探针显著降低了RCC细胞中的circTLK1（图4c）。我们的结果显示miR-136-5p是肾癌细胞中仅有的被生物素化circTLK1探针大量拉下的miRNA（图4d）。此外，我们构建了野生型（WT）和突变型（Mut）circTLK1荧光素酶报告子，以检测miR-136-5p在circTLK1活性调节中的作用。转染后，我们观察到miR-136-5p的过表达显著抑制WT-circTLK1荧光素酶报告活性，但不抑制Mut-circTLK1荧光素酶报告活性（图4e，f）。然而，circTLK1的过表达或敲除对肾癌细胞miR-136-5p的表达没有影响（图4g，h）。此外，miR-136-5p的过表达或敲除并不调节RCC细胞中circTLK1的表达（图4i，j）。这些实验都表明circTLK1作为miR-136-5p的海绵。

5.miR-136-5p通过靶向CBX4促进肾癌进展
    为了确定miR-136-5p的潜在基因，我们利用TargetScan、miRDB、Starbase和miRTarBase数据库进行了生物信息学分析，选择CBX4、GNAS、LUZP6、MSL2、MTMR4和SOCS7作为miR136-5p的潜在靶点（图5a）。进一步的综合转录分析表明miR-136-5p表达与CBX4表达呈负相关（图5b）。为了研究CBX4是否可能是miR-136-5p的靶点，使用含有miR-136-5p结合序列的CBX4的3'UTR的WT或Mut序列合成荧光素酶报告质粒（图5c）。荧光素酶报告分析结果表明，miR136-5p模拟物和CBX4-WT质粒的共转染显著降低了荧光素酶的活性。然而，miR-136-5p模拟物和CBX4 Mut质粒的共转染并没有改变荧光素酶的活性（图5d）。此外，miR-136-5p的强制表达抑制了C B x 4的mRNA和蛋白表达（5e-g）。接下来，我们检测了CBX4在肾癌进展中的作用。如图5h所示，与正常组织相比，RCC组织中CBX4表达上调。我们发现CBX4的表达与肿瘤大小和术后转移呈正相关（图5i，j）。此外，肾细胞癌患者中CBX4的高表达与较低的总生存率相关（图5k）。

6.CBX4基因敲除抑制RCC细胞增殖、迁移和侵袭
    我们研究了CBX4在肾癌细胞表型中的作用。使用shRNA靶向circTLK1，我们有效地抑制了其在ACHN和769-P细胞中的表达（图6a）。通过CCK-8分析，我们发现沉默CBX4显著抑制ACHN和769-P细胞的增殖（图6b，c）。结肠形成实验还表明，CBX4的敲除大大削弱了RCC细胞的增殖能力（图6d，e）。进一步的实验表明，沉默CBX4显著抑制ACHN和769-P细胞的迁移和侵袭（图6f-i）。此外，我们发现CBX4的mRNA水平与TCGA数据库和我们的数据集（图6j）中的VEGF mRNA水平正相关。CBX4基因敲除抑制VEGFA的mRNA和蛋白质水平（图6k）。

7.CBX4过表达逆转circTLK1抑制细胞增殖和转移的作用
    为了探讨circTLK1是否通过调节CBX4的表达而发挥其生物学功能，我们进行了挽救实验。我们发现敲除circTLK1明显抑制CBX4的mRNA和蛋白表达（图7a，b）。CCK-8分析显示CBX4过表达显著逆转了circTLK1抑制诱导的ACHN和769-P细胞生长曲线抑制（图7c）。菌落形成分析表明，强制表达CBX4逆转了circTLK1沉默诱导的细胞增殖抑制（图7d，e）。此外，CBX4上调显著逆转了circTLK1沉默诱导的RCC细胞迁移（图7f-i）和侵袭（图7j，k）抑制。

8.circTLK1基因敲除抑制RCC细胞在体内的生长和转移
    为探讨circTLK1在RCC体内生长和肺转移中的作用，将转染shcircTLK1或shNC的稳定769-P细胞注入裸鼠体内，建立裸鼠移植瘤和肺转移模型。在异种移植瘤模型中，来自转染shcircTLK1的细胞的肿瘤比来自转染shNC的细胞的肿瘤小（图8a）。circTLK1基因敲除显著抑制肿瘤体积和重量（图8b-c）。此外，敲除circTLK1抑制CBX4和VEGFA在体内的mRNA表达（图8d）。IHC分析表明，circTLK1的表达降低抑制了Ki67、CBX4和VEGFA的表达（图8e）。在裸鼠肺转移模型中，抑制circTLK1导致肺转移显著减少（图8f-g）。此外，HE染色显示shcircTLK1组的肺肿瘤灶比shNC组少（图8h）。异种移植瘤模型显示CBX4的过表达逆转了circTLK1的沉默导致的细胞生长抑制（图8i-k）。总之，circTLK1通过海绵化miR513a-5p调节CBX4的表达促进肾癌的生长和转移（图8l）。

结 论：
    circTLK1通过吸收miR-136-5p来增加CBX4的表达，在RCC进程中发挥关键作用。circTLK1可能作为RCC的诊断生物标志物和治疗靶点。