miR-26a调节前列腺癌细胞胞外囊泡的分泌

    细胞外囊泡（EV）参与癌症进展过程中的细胞间通讯，因此，阐明肿瘤细胞中EV分泌的机制将有助于EV靶向肿瘤治疗的发展。今天小编给大家介绍发表于“SCIENCE ADVANCES”上的文章“miR-26a regulates extracellular vesicle secretion from prostate cancer cells via targeting SHC4, PFDN4, and CHORDC1”，带大家详细了解EVs参与前列腺癌进展的机制。

    在这里，我们进行了基于miRNA的高通量筛选，使用外筛试验来识别EV分泌的调节因子。通过这种方法，我们鉴定了miR-26a参与前列腺癌（PCa）细胞的EV分泌。此外，我们发现SHC4、PFDN4和CHORDC1基因在PCa细胞中调节EV的分泌。在体内研究中，这些基因被抑制。
结 果：
1.PCa中调控EV分泌的miRNA的筛选
    首先，我们将PC3M细胞接种于96孔板中，用miRNA模拟物进行转染。转染24小时后，将培养基改为无血清培养基，再孵育48小时。之后，收集CM，评估EV水平（图1A）。我们对传统的EV标记物进行免疫印迹，并通过免疫印迹确认来源于PC3M的EV为CD9和CD63阳性（图1B）；因此，我们使用CD9抗体检测第一次筛查中CD9/CD9双阳性EV分泌的变化。
    接下来，我们进行了miRNA的筛选。根据图1C所示的标准选择miRNAs。我们进行了三次筛选并选择了58个miRNAs。在排除数量大于2000的miRNAs后，我们选择了30个miRNAs（图1C）。接下来，为了进一步验证最初的筛选，我们评估这30个miRNAs中CD63/CD63阳性EVs和CD9/CD63双阳性EVs的分泌情况。根据EV分泌/细胞活力相对值低于0.8的标准，我们选择miR-26a和miR-194作为调节EV分泌的候选miRNA（图1D）。与正常前列腺组织相比， miR-26a在前列腺癌组织中显著下调，而miR-194的表达与正常前列腺组织相比没有差异（图1E）。这些结果提示miR-26a参与PCa的EV分泌。此外，转染miR-26a模拟物的PCa细胞分泌的EVs颗粒数显著减少（图1F，G）。因此，选择miR-26a进行下一步分析，并探讨miR-26a是否调节PCa中EV的分泌。

2.SHC4、PFDN4和CHORDC1参与miR-26a介导的EV分泌
    为了进一步阐明miR-26a在EV分泌中的分子机制，我们鉴定了miR-26a的靶基因。在miR-26a模拟物或对照物转染后，对PC3M和PC3进行mRNA微阵列分析。发现PCa细胞中miR26a的过表达下调了88个基因（图2A）。然后，为了筛选调节EV分泌的基因，利用ExoScreen进行高通量筛选。将PC3M细胞接种于96孔板上，转染88个候选基因的siRNA。转染24小时后，将培养基改为无血清培养基，培养48小时。从转染的PC3M细胞中，收集CM，通过ExoScreen和MTS分析评估EV水平（图2B）。CD9-和CD63-阳性的EVs通过ExoScreen进行评估。所选基因的标准如图2C所示。最后，SHC4，PFDN4，CHORDC1和PRKCD被确定为调节EV分泌的候选基因（图2C）。接着，我们探究这些基因对siRNA处理后PCa细胞分泌EVs的影响。发现转染SHC4、PFDN4和CHORDC1三个基因的siRNAs后，PCa细胞分泌的EV水平降低，表明这些基因是EV分泌的调节因子（图2D和E）。qRT-PCR证实了转染siRNA的PCa细胞中这三个基因的下调（图2F）。这些结果提示SHC4、PFDN4和CHORDC1参与了PCa中EV分泌的上调。

3.miR-26a通过靶向SHC4、PFDN4和CHORDC1抑制PCa癌细胞EV分泌
    通过qRT-PCR和免疫印迹分析，发现miR-26a抑制PCa细胞中SHC4、PFDN4和CHORDC1的表达水平（图3A）。然后，为了确定miR-26a是否直接调控这些基因，进行了荧光素酶报告分析（图3B）。发现miR-26a的异位表达显著抑制野生型SHC4、PFDN4和CHORDC1 3’UTRs的荧光素酶活性（图3C）。此外，我们还研究了这些基因在PCa组织中的表达水平。发现PCa组织中PFDN4和CHORDC1的表达水平明显高于正常组织（图3D）。

4.PFDN4、SHC4和CHORDC1在体内调节EV分泌和促进肿瘤发生
    miR-26a抑制PCa的肿瘤形成，其抗肿瘤活性可能与miR-26a抑制PCa细胞分泌EV有关。为了证实miR-26a靶向基因在PCa衍生EVs中的作用，我们进行了体内实验。研究发现，这些基因的缺失抑制了EV的分泌（图4A）。我们评估了SHC4、PFDN4和CHORDC1下调在该模型中的作用，发现缺失这些基因的异种移植的小鼠肿瘤较小，重量小于对照小鼠（图4B，C）。此外，注射PC3M来源的EVs的裸鼠肿瘤组织显示部分挽救的肿瘤大小和重量（图4D）。上述数据表明，miR26a与其靶基因SHC4、PFDN4和CHORDC1之间存在一个信号网络，并证明了miR-26a在PCa中调节EV分泌的新机制（图5）。

结 论：
    本研究广泛筛选了PCa中调节EV分泌的miRNA，发现miR-26a通过靶向SHC4、PFDN4和CHORDC1调节EV分泌。这一发现揭示了miRNA通过抑制EV生物发生抑制肿瘤的新思路，为PCa的治疗提供了新的途径。