胆道梗阻——肿瘤细胞微泡帮你来疏通

        胆管癌（CCA）是一种上皮恶性肿瘤，其5年生存率极低。其中90％以上的CCA来自肝外胆管，容易形成恶性胆道梗阻。手术切除肝外CCA（ECCA）的复发率仍然很高，目前的标准化学疗法或放射疗法并未提高生存率。目前，胆道引流已成为不可切除患者的标准治疗方法。这种治疗可以使胆红素水平正常化，从而提高整体生存率。然而，由于诸如支架迁移、支架阻塞，肿瘤向内生长、感染和胆管炎等并发症，长期胆道引流仍然具有挑战性。基于治疗ECCA的这些困难，研究治疗策略至关重要。2020年7月6日，来自中国医学科学院黄波、刘玉英、天津医科大学王西墨等人合作在Nature Biomedical Engineering杂志上发表了一篇文章“Methotrexate-loaded tumour-cell-derived microvesicles can relieve biliary obstruction in patients with extrahepatic cholangiocarcinoma.”（影响因子18.952），该研究报道了甲氨蝶呤负载的肿瘤细胞微泡可缓解肝外胆管癌患者的胆道梗阻。

结 果:
一、MTX–TMP灌注可有效治疗阻塞性CCA
        首先对患有恶性胆道梗阻的晚期ECCA（n = 20）患者进行经皮肝穿刺胆道引流术（PTBD），然后将负载甲氨蝶呤（MTX）的TMP（MTX–TMPs）（20ml含有6×107 MPs和120μgMTX）注入肿瘤上方的胆管腔质量，然后关闭2小时的管，这使MTX–TMP发挥作用。然后，作者打开导管并收集胆道引流。根据粪便颜色的变化，胆管造影显示20例患者中有5例梗阻得到缓解（图1a）。此外，在治疗后，阻塞缓解可能会持续较长时间。例如，一名患者接受MTX-TMP治疗后，胆管梗阻可缓解长达5个月（图1b）。这些结果表明，MTX-TMPs可用于治疗患有胆道梗阻的ECCA患者。

二、MTX–TMP灌注吸引中性粒细胞
        接下来，作者研究了MTX-TMP灌注治疗阻塞性CCA的潜在机制。HE染色显示肿瘤周围细胞外基质和基底膜的密度很高（图2a）。重点是，肿瘤组织可以被胶原酶溶解，导致CD45-肿瘤细胞的释放。但是，TMP或MTX-TMP与肿瘤组织的孵育没有相似的效果（图2b），这表明TMP本身可能不会直接降解基质。因此，可能会响应MTX-TMPs释放特定因子，这可能会破坏基质结构并允许TMP获得进入CCA细胞的通道。对胆汁引流年龄的流式细胞仪分析表明，治疗前CCA患者的胆汁中存在少量免疫细胞，但是MTX-TMP灌注显着增加了胆管中免疫细胞的数量（图2c）。大多数其他免疫细胞是嗜中性粒细胞，有一些巨噬细胞，但很少有T细胞，B细胞或其他免疫细胞（图2d，e）。值得注意的是，在引流（图2f，g）中检测到了中性粒细胞相关的组织降解酶弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶8（MMP8）。这些酶在引流中的水平与其他中性粒细胞的数量呈正相关（图2h，i）。这些结果表明，MTX-TMP灌注有效地将中性粒细胞募集到胆汁中，在那里它们释放弹性蛋白酶和MMP8，从而削弱了基质屏障并允许MTX-TMP获得进入CCA细胞的通道。

三、中性粒细胞被MTX–TMP中的UDPG和C5直接吸引
        接下来，作者研究了中性粒细胞在MTX–TMP灌注过程中如何被胆汁吸引。Transwell测定发现MTX–TMP能够吸引中性粒细胞从上腔室迁移至下腔室（图3a，b），这表明MTX–TMPs能够募集中性粒细胞。当UDPG注入UDPG时引起中性粒细胞积累小鼠腹膜腔（图3d，e）。 Transwell分析还显示UDPG吸引了中性粒细胞（补充图3g）。在TMP，MTX–TMP或其他药物–TMP中无法检测到UTP水平。因此，增加的UDPG可能不是由于MTX治疗的HL-60肿瘤细胞中UTP增加。作者观察到，MTX处理显着上调了参与糖原合成的酶的表达，导致HL中糖原和UDPG的水平增加-60个细胞（图3f）。来自UGP2-/-HL-60细胞的MTX-TMPs中性粒细胞吸引力显着降低（图3i），这表明UDPG的存在使中性粒细胞被MTX-TMP吸引。  C5a是一种ana phylatoxin，可以吸引粒细胞。与其他药物相比，MTX处理可显着增加HL-60细胞和衍生的TMP中C5的表达（图3j）。C5组合式减弱了MTX-TMP介导的中性粒细胞吸引力（图3k）。作者还发现，源自C5或UDPG缺陷的HL-60细胞的MTX–TMPs几乎完全丧失了吸引中性粒细胞的能力（图3k），这表明中性粒细胞的吸引力是依赖的在C5和UDPG上。重要的是，在MTX-TMP灌注后，作者观察到患者胆汁引流中UDPG和C5浓度增加（图3l）。总之，MTX-TMP灌注能够通过UDPG和C5依赖性途径吸引嗜中性粒细胞。

四、MTX–TMPs诱导CCA细胞凋亡
        流式细胞仪和H＆E染色分析了五名患者的引流胆汁中的肿瘤细胞，作者发现MTX–TMP灌注以时间依赖性方式导致CD45−肿瘤细胞死亡（图4a）。灌注之前，约有1.8％的CD45-肿瘤细胞死亡。然而，治疗后，死亡的肿瘤细胞的平均比例分别在4h后增加到9％，在24h和48h之后分别增加到20％和25％（图4a）。为了验证MTX–TMP杀死CCA细胞的能力，作者在体外将MTX–TMP与CCA细胞一起孵育。结果表明，只有MTX–TMP，而不是单独使用药物或不含药物的TMP，对肿瘤细胞具有细胞毒性作用（图4b，c）。MTX-TMP介导的细胞毒性似乎诱导了坏死样的形态改变，这是由垂死的细胞与质膜上的特征性大气泡肿胀所证实的（图4c）。大量的胞质成分乳酸脱氢酶（LDH）被释放到上清液中（图4d），表明程序性坏死细胞死亡。蛋白质印迹分析表明，MTX-TMP处理的人RBE CCA细胞均未激活MLKL和GSDMD。然而，GSDME被显着激活（图4e）。更重要的是，发现从PDX小鼠模型中分离出的人类原代CCA细胞表达高水平的GSDME，MTX-TMP处理导致活性GSDME的产生（图4g）。与CCA细胞凋亡一致，作者还发现5例患者在MTX–TMP灌注后引流中LDH水平升高（图4h）。总之，通过GSDME途径进入肿瘤的MTX-TMP触发了CCA细胞的热凋亡。

五、MTX–TMP灌注触发了第二次招募中性粒细胞的浪潮
        作者假设，MTX-TMP介导的焦细胞凋亡触发了中性粒细胞向胆管迁移的第二波。经验证发现，来自焦光CCA细胞的上清液可以有效吸引中性粒细胞（图5a）。并且用焦磷酸化CCA细胞上清液处理的巨噬细胞不仅上调了IL-6和CCL2，而且还产生了嗜中性粒细胞引诱剂肿瘤坏死因子（TNF），IL-1β，CCL3，CCL20和CXCL5（图5b）。巨噬细胞的上清液能够有效地吸引嗜中性粒细胞（图5c），这表明经热解刺激的巨噬细胞具有吸引中性粒细胞的能力。MTX–TMP处理过的人类单核细胞衍生的巨噬细胞还产生了多种细胞因子，例如IL-6，CCL2，CCL3，CCL20和中性粒细胞引诱剂CXCL1，CXCL5和TNF（图5d）。此外，两种吸引巨噬细胞的化学因子CCL2和CCL3以及一种天然的吸引T细胞的趋化因子CCL20在引流中也升高了（图5e）。总之，在MTX-TMP灌注后，UDPG对中性粒细胞产生了最初的吸引力之后，出现了第二次中性粒细胞募集的浪潮。

六、MTX–TMP灌注诱导的中性粒细胞显示出抗肿瘤表型
        为了阐明募集的中性粒细胞在胆管中的作用，作者从患者中分离了中性粒细胞，并将其与CCA细胞孵育。作者发现这些中性粒细胞具有杀死肿瘤细胞的能力（图6a）。在MTX-TMP灌注后，胆汁中性粒细胞和胆汁引流年龄发现活性氧ROS和NO水平升高（图6b，c）。作者检查了MTX-TMP对嗜中性粒细胞的作用，发现处理过的细胞具有杀死CCA细胞的能力（图6d），同时伴随着ROS水平的升高（图6e）。此外，作者发现，MTX-TMP处理过的RBE细胞的焦上清液还赋予嗜中性粒细胞杀死CCA细胞的能力，并增加了ROS水平（图6f，g）。总之，MTX-TMP灌注触发了多种途径，这些途径将胆汁浸润性中性粒细胞引导至抗肿瘤表型。

结 论:
        这项研究的结果表明，含有MTX的MTP通过动员和激活中性粒细胞，可以作为一种免疫治疗剂，有效治疗阻塞性ECCA。 与不攻击肿瘤细胞的常规靶向嗜中性白细胞的免疫治疗剂（例如Coley毒素和卡介苗杆菌Calmette-Guérin免疫疗法）不同，MTX-TMP也能够直接杀死肿瘤细胞。 更重要的是，这种杀伤作用可诱导肿瘤细胞发生热解性死亡，从而产生强烈的炎症信号，从而压倒肿瘤的威压并赋予肿瘤浸润性嗜中性粒细胞以抗肿瘤表型。