一种可能导致肝癌抗PD1治疗耐药性的新机制

        自然杀伤（NK）细胞在先天性抗肿瘤免疫反应中起关键作用。最近，已经在包括肝细胞癌（HCC）在内的各种恶性肿瘤中证实了NK细胞功能障碍。然而，人类肝癌中NK细胞功能障碍的分子生物学机制仍然不清楚。6月27日，来自复旦大学中山医院肝癌研究所的张鹏飞团队在molecular cancer（IF=15.302）上发表论文。他们报道在人类HCC组织中circUHRF1的表达高于在匹配的相邻非肿瘤组织中的表达。 circUHRF1水平升高表明HCC患者的临床预后较差，NK细胞功能异常。在HCC患者血浆中，circUHRF1主要通过外泌体方式由HCC细胞分泌，而circUHRF1抑制NK细胞衍生的IFN-γ和TNF-α的分泌。血浆外泌体circUHRF1的高水平与NK细胞比例减少和NK细胞肿瘤浸润减少有关。此外，circUHRF1通过miR-449c-5p的降解上调TIM-3的表达来抑制NK细胞的功能。最后，他们表明circUHRF1可能会导致HCC患者抗PD1免疫疗法产生抗药性。以上结果为HCC患者提供潜在的治疗策略。
技术路线：

结 果：
1.肝癌组织中与UHRF1相关的circRNA的分析
        UHRF1经常被上调，并且在HCC的进展中起着关键的病理作用。因此，通过qRT-PCR检查了从UHRF1衍生的14个circRNA的水平。其中，hsa_circ_0048677（circUHRF1）是最丰富的circRNA，在HCC组织中被上调（图1a和b）。然后，通过qRT-PCR检查了circUHRF1在240例HCC组织和匹配的邻近非肿瘤组织中的表达。 HCC组织中CircUHRF1的表达明显高于相邻的非肿瘤组织（肿瘤/相邻的非肿瘤组织≥2； 136/240）（图1c和d）。接下来探究circUHRF1表达与240例HCC患者的临床病理特征之间的关系。结果表明，circUHRF1表达与临床病理特征显著相关（图1e-g）。Kaplan-Meier生存分析表明，circUHRF1高表达水平的患者的临床预后较差（图1h和i）。综上所述，HCC细胞中circUHRF1表达上调与患者不良预后相关，并表明circUHRF1表达增加可能与HCC的进展有关。

2.HCC细胞以外泌体方式分泌circUHRF1
        假设circUHRF1可以通过外泌体从HCC细胞转移到其他细胞。为了验证这一假设，从HCC细胞系上清液中分离了外泌体，并通过TEM和Western印迹进行了评估（图2a和b）。在六个HCC细胞系和成对的外泌体中进行qRT-PCR分析，结果与其他细胞系相比，HCCLM3和SMMC-7721细胞系中circUHRF1明显上调，外泌体表达结果与亲代细胞的表达水平一致（图2c和2d）。与20名健康捐献者相比，HCC患者血浆外泌体circUHRF1水平升高（图2e）。此外，肿瘤切除后血浆外泌体circUHRF1水平降低，而在肿瘤复发患者中血浆外泌体circUHRF1水平升高，表明血浆外泌体circUHRF1主要由HCC细胞产生（图2e）。有免疫逃逸的患者血浆中外泌体circUHRF1水平显著升高，外周血中NK细胞比例降低（图2f）。这些数据表明血浆外泌体circUHRF1可以作为NK细胞相关的免疫逃逸的关键分子。

3.HCC细胞通过外泌体circUHRF1抑制NK细胞功能
        为了确定HCC衍生的外泌体circUHRF1是否能诱导异体NK细胞发生改变，将来自6个健康供体的NK细胞与HCCLM3和SMMC-7721细胞以1：1的比例共培养24小时（图3a）。与SMMC-7721和HCCLM3细胞共培养的NK细胞表现出IFN-γ和TNF-α分泌的显著损害，circUHRF1表达显著增加（图3a-d），这被外泌体抑制剂GW4869削弱（图3e）。NK细胞与SMMC-7721和HCCLM3细胞先共培养，再用外泌体抑制剂处理，IFN-γ和TNF-α的分泌减弱（图3f和g）。为了进一步研究是否以外泌体circUHRF1依赖性方式介导HCC细胞对NK细胞功能的抑制作用，使用SMMC-7721和shRNA慢病毒载体建立了circUHRF1表达下调细胞。结果表明，外泌体circUHRF1水平的降低可有效减弱NK细胞中HCC衍生的外体诱导的IFN-γ和TNF-α分泌的损伤（图3h-j）。这些结果共同表明，源自HCC的外泌体circUHRF1能损害NK细胞的功能。

4.CircUHRF1和miR-449c-5p在NK细胞中彼此降解
        通过StarBase v3.0分析，预测有14个miRNAs可能是circUHRF1的靶标。使用circUHRF1特异性探针进行circRNA体内沉淀（circRIP），并使用qRT-PCR检测了与circUHRF1形成复合体的14种预测miRNA。结果表明，与阴性对照相比，circUHRF1和miR-449c-5p显著富集（图4a），表明miR-449c-5p是与circUHRF1相互作用的miRNA。接下来进行一系列实验来验证这一结果（图4b-e）。此外，在NK-92细胞中过表达miR-449c-5p后circUHRF1的水平显著降低，而在circUHRF1过表达后miR-449c-5p的水平显著降低（图4f和g）。这些发现表明，circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向，在NK细胞中相互影响。

5.CircUHRF1通过抑制miR-449c-5p活性上调TIM-3表达
        推测circUHRF1可能充当miR-449c-5p海绵通过上调miR-449c-5p靶标的表达水平增强HCC患者的免疫逃逸。为了验证这一假设，首先分析了包括TIM-3在内的NK细胞中一组预测的miR-449c-5p靶基因（图5a）。接下来进行了实验验证TIM-3是miR-449c-5p的靶基因（图5b-d）。鉴于TIM-3相关途径在免疫逃逸中的关键作用，假设circUHRF1可能通过其竞争性circRNA活性成为HCC免疫逃逸的重要助力者。为了进一步验证这一假设，在单独或与circUHRF1一起转染miR-449c-5p模拟物的NK-92细胞中检测到TIM-3表达。结果表明， miR-449c-5p强迫表达导致TIM-3的mRNA和蛋白表达水平降低，而circUHRF1逆转了miR-449c-5p对TIM-3表达的这种抑制作用（图5b和c）。为了进一步证实体外研究结果，调查了另一40例HCC患者中circUHRF1和miR-449c-5p / TIM-3表达之间的相关性外周NK细胞。发现circUHRF1表达与外周NK细胞中的miR-449c-5p表达负相关，circUHRF1表达与周围NK细胞中TIM-3 mRNA表达正相关，miR-449c-5p表达与外周NK细胞中TIM-3 mRNA的表达负相关（图5e-g），表明外泌体circUHRF1的上调消除了miR-449c-5p对NK细胞中TIM-3的抑制作用。

6.CircUHRF1以NK细胞依赖性方式诱导HCC进展
        为了进一步探索circUHRF1在肝癌中的功能，使用了pLO5-ciR-circUHRF1慢病毒载体来上调circUHRF1在PLC / PRF / 5细胞中的表达。 qRT-PCR结果显示，转染pLO5-ciRcircUHRF1的PLC / PRF / 5细胞的circUHRF1水平显著高于转染pLO5-ciR-Mock的细胞中的circUHRF1并且外泌体更高的circUHRF1水平（图6a和6b）。使用PLC / PRF / 5细胞生成了NOD / SCID小鼠肺肿瘤转移模型。结果表明，与转染pLO5-ciR-Mock的HCC细胞相比，转染pLO5-ciR-circUHRF1的PLC / PRF / 5细胞显示出circUHRF1水平升高，诱导的转移性肿瘤结节数目明显增加，NKG2D阳性细胞数量明显减少（图6c-e）。这些结果表明circUHRF1以外泌体和NK细胞依赖性方式促进HCC进展。

7.CircUHRF1增强了肝癌抗pd1治疗的耐药性
        由于强制circUHRF1表达抑制了HCC中的NK细胞功能，因此评估了circUHRF1过表达是否可以进一步阻止抗PD1治疗（Opdivo）的抗肿瘤作用。分析了30例接受抗PD1免疫治疗的复发性远处转移（包括肺转移）的HCC患者的回顾性数据。根据RECIST1.1分析，结果显示，部分缓解（PR）3例，疾病稳定（SD）7例，进行性疾病（PD）20例，PD组的circUHRF1表达水平远高于SD和PR组（图7a）。为了进一步探讨circUHRF1与免疫逃避之间的关系，检查了30例HCC患者组织中NKG2D的表达。与对PD1敏感的HCC患者相比，对PD1耐药的HCC患者的NKG2D阳性细胞数量明显减少（图7b）。分析显示，HCC组织中circUHRF1表达与NKG2阳性细胞数之间呈负相关（R2 = 0.1452； P = 0.0377）（图7c）。为了进一步评估circUHRF1对抗PD1治疗的抗性，通过皮下植入circUHRF1基因下调的HCCLM3细胞或相应的阴性对照细胞建立了异种移植模型。结果表明，植入circUHRF1基因敲低的细胞可提高对抗PD1治疗的敏感性，并提高总生存率（图7d-f）。综上所述，这些发现表明circUHRF1过表达可能会阻碍HCC对抗PD1治疗的反应，而靶向circUHRF1可能是恢复HCC对抗PD1治疗敏感性的有前途和有效的方法。

参考文献：
        Zhang Peng-Fei., Gao Chao., Huang Xiao-Yong., Lu Jia-Cheng., Guo Xiao-Jun., Shi Guo-Ming., Cai Jia-Bin., Ke Ai-Wu.(2020). Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer, 19(1), 110. doi:10.1186/s12943-020-01222-5