circRNA 001971通过VEGFA促进结直肠癌

        CRC（结直肠癌）是一种恶性的实体肿瘤，抑制血管生成(主要通过阻断VEGF(血管内皮生长因子)家族及其相应受体)已被证实可延长包括CRC在内的患者的总体生存期。VEGFA被认为是最重要的肿瘤细胞分泌促血管生成因子之一。进一步研究CRC中VEGFA异常上调的机制，可能为转移性CRC治疗提供新的策略。
        基因表达受到一些circRNAs的调控，这些circRNAs充当ceRNAs(竞争性内源性RNA)，也被认为是miRNAs的海绵，影响miRNAs的活性。circRNAs阻止miRNAs调控其靶基因。基于以上研究背景，中南大学Chen Chen等人在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志（IF=7.06）发表文章探究circRNAs通过调节VEGFA对结直肠癌的影响。

技术路线：

研究结果：
1.选择circ-001971
        文章首先根据以往的文献报道筛选出11个在CRC肿瘤组织中高表达的circRNAs，然后利用RT-PCR检测这11个circRNAs在肿瘤组织和正常组织中表达差异最大的，发现有3个circRNAs表达差异较大，其中circ-001971差异最大。之后，进一步在70个组织样本中检测，发现circ-001971在正常和肿瘤组织中表现出差异。COX回归实验发现circ-001971的表达与肿瘤分期和淋巴结转移有关，低表达的circ-001971显示出更高的总体生存率，ROC曲线显示circ-001971具有潜在的诊断和预后能力。

2. circ-001971对CRC细胞增殖、侵袭和HUVEC血管生成的影响
        实验中选择了5中CRC细胞系(HT29, HCT116, LoVo, SW480和 SW620)和正常细胞系FHC，同在组织中的结果一样，circ-001971在肿瘤组织中的表达比正常组织中多，尤其是HCT116和SW620细胞。之后，筛选出合适的沉默circ-001971的序列并在沉默circ-001971的细胞中检测，发现沉默的细胞中DNA的合成能力、细胞活力和细胞的侵袭都显著降低。最后，收集沉默和对照细胞中的细胞上清，并用来孵育HUVEC细胞，发现circ-001971低表达降低HUVEC管腔形成能力。

3.在体内实验中，circ-001971对CRC生长的影响
        研究中采用慢病毒敲低circ-001971，6只小鼠平均分为2组，皮下注射SW620细胞转染沉默circ-001971或对照的慢病毒载体，结果显示，circ-001971敲低之后显著降低肿瘤的体积和肿瘤的重量。以上结果表明在体内实验中，circ-001971敲低抑制CRC肿瘤的生长。

4. 选择并验证与circ-001971和CRC血管生成有关的miRNA
        研究显示circRNAs作为miRNA的海绵来减轻miRNA对下游靶基因的抑制。GSE126093和TargetScan预测miR-29c-3p, miR-497-5p, and miR-943靶向circ-001971。之后，为了找到与circ-001971、CRC血管生成有关的miRNA，实验在2种细胞中过表达3种miRNAs并发现3中miRNAs过表达时circ-001971和VEGFA的表达降低并且miR-29c-3p能显著抑制circ-001971的表达。之后，在细胞中抑制miR-29c-3p，circ-001971表达上调；抑制circ-001971，miR-29c-3p表达上调说明两者的相互调节关系。而且，miR-29c-3p过表达显著降低VEGFA的蛋白水平，miR-29c-3p抑制时升高VEGFA的蛋白水平说明两者的调控关系。

5. MiRNA-29与circ-001971和VEGFA直接结合
        实验中采用荧光素酶报告实验验证miR-29c-3p结合circ-001971 和 VEGFA。并进一步用RIP实验验证，结果显示结果显示circ-001971、VEGFA、miR-29c- 3p与AGO2相关; 这些数据证实circ-001971和VEGFA结合miR-29c-3p以AGO2相关的方式。

6.circRNA/miR-29-3p信号调节HUVECs的管腔形成能力
        在两种细胞系中， miR-29c-3p抑制时增强VEGFA蛋白水平和管腔形成能力，敲低circ-001971降低VEGFA蛋白水平和管腔形成能力，而抑制miR-29c-3p逆转了circ-001971对VEGFA蛋白表达和管腔形成能力的影响（理解：挽救实验）。这些结果表明.circRNA/miR-29-3p轴调节VEGFA蛋白水平和HUVECs的管腔形成能力。

7.组织样本中miR-29c、 VEGFA的表达及其与circ- 001971的相关性
        肿瘤组织中，PCR结果显示miR- 29c-3p的表达降低而VEGFA的表达增强。WB和IHC结果显示肿瘤组织中VEGFA表达增强。另外，miR-29c-3p与circ- 001971和VEGFA呈负相关，而circ-001971与VEGFA呈正相关。

总 结：
1.肿瘤组织中，VEGFA表达上调，而 miR-29c-3p表达下调。
2. miR-29c-3p与circ-001971、VEGFA呈负相关关系，而circ-001971 和VEGFA呈正相关关系。
3. circ-001971/miR-29c-3p通过VEGFA调节CRC增殖、侵袭和血管生成。
4.为研究circRNA-miRNA-mRNA网络对CRC的影响提供了新的理论基础。

参考文献：
Chen C , Huang Z , Mo X , et al. The circular RNA 001971/miR-29c-3p axis modulates colorectal cancer growth, metastasis, and angiogenesis through VEGFA [J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2020, 39(1).