m6A阅读器YTHDF1促进卵巢癌的进展

        m6A是哺乳动物mRNA中最丰富的RNA修饰，越来越多的证据表明m6A在人类肿瘤发生中起着关键作用。然而，m6A的阅读器YTHDF1，是否针对一个参与蛋白质翻译的基因，从而影响癌细胞的整体蛋白质生产，目前还没有很多的研究。因此小编为大家详细介绍发表于“Nucleic Acids Research”杂志的文章“The m6A reader YTHDF1 promotes ovarian cancer progression via augmenting EIF3C translation”。在这里，通过对卵巢癌的多组分分析，我们确定了一种新的机制。YTHDF1通过与m6A修饰的EIF3C mRNA结合以m6A依赖的方式增强EIF3C的翻译，同时促进整体翻译输出，从而促进卵巢癌的发生和转移。

结果：
1.YTHDF1在卵巢癌中高表达
        为了研究m6A相关基因在卵巢癌发展中的作用，我们首先利用cBioPortal TCGA数据集分析这些基因的遗传改变和表达水平。其中YTHDF1基因最常被扩增，其表达显著升高，并且YTHDF1的拷贝数状态与其在所有三个队列中的mRNA表达呈正相关（图1A-C）。与正常卵巢上皮细胞相比，YTHDF1在卵巢癌中表达上调（图1D和E）。此外，我们进行了Kaplan-Meier生存分析，发现高表达YTHDF1的卵巢癌患者总体生存率和无病生存率较差（图1F）。为了更准确地检测YTHDF1在卵巢癌中的表达，我们进行了组织芯片分析。结果显示，YTHDF1蛋白在卵巢癌样本中的表达高度增强（图1G和H）。同时，这些结果提示m6A读卡器YTHDF1在卵巢癌中高表达，并与卵巢癌患者的不良预后相关。

2.YTHDF1调节卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭
        为了探讨YTHDF1在卵巢癌中的作用，我们试图对缺失YTHDF1的卵巢癌细胞的表型改变进行研究。shY1-1和shY1-2在A2780和SKOV3卵巢癌细胞中有效地击倒了YTHDF1（图2A）。通过CCK8检测，YTHDF1基因敲除显著损害A2780和SKOV3细胞的生长（图2B）。此外，EdU染色显示YTHDF1沉默后卵巢癌细胞的增殖显著降低（图2C和D）。菌落形成分析显示，YTHDF1基因敲除后克隆形成能力受到抑制（图2E）。此外，细胞迁移和侵袭分析显示，YTHDF1缺陷损害了A2780和SKOV3细胞的迁移和侵袭能力（图2F和G）。提示YTHDF1在卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭中起重要作用。

3.YTHDF1缺乏抑制卵巢癌细胞在体内的肿瘤发生和转移
        为了评价YTHDF1在卵巢癌体内的致癌作用，我们采用皮下肿瘤模型和腹膜转移异种移植模型。首先，在裸鼠皮下分别注射YTHDF1缺陷的A2780卵巢癌细胞和对照细胞。研究表明，来自YTHDF1缺陷组的肿瘤明显小于来自对照组的肿瘤（图3A）。同时，与对照组相比，YTHDF1基因敲除小鼠的平均肿瘤体积和牺牲时的体重显著降低（图3B和C）。我们还评估了这些实体瘤的细胞增殖和凋亡指数。与对照细胞相比，YTHDF1沉默的肿瘤显示出Ki-67信号降低，但caspase-3活性增加（图3D-F）。注射YTHDF1沉默的细胞实质上消除了细胞在腹腔内形成二次肿瘤的能力（图3G）。总之，这些结果显示了YTHDF1通过调节细胞增殖和转移在卵巢癌中的致癌作用。

4.卵巢癌YTHDF1靶点的鉴定
        为了探讨YTHDF1在卵巢癌发生发展中的作用机制，我们对YTHDF1基因敲除后的A2780细胞进行了RNA序列分析。YTHDF1缺失导致1715个基因发生改变，包括633个上调基因和1082个下调基因（图4A）。MAPK信号途径、肿瘤抑制和细胞迁移调控多种富集途径和基因集富集分析（GSEA）揭示了YTHDF1基因的改变与蛋白质磷酸化、凋亡信号途径、MAPK途径、ERK级联和细胞活化等信号转导有关（图4B-F），支持YTHDF1在卵巢癌发生中的调节作用。
        YTHDF1起着m6A阅读器的作用，通过结合和影响m6A甲基化转录本发挥作用。我们分析确定了m6A共有基序（GGAC），表明m6A修饰的mRNA成功富集（图4G）。这些m6A修饰主要位于蛋白质编码转录本中，并在终止密码子附近富集（图4H 和4 I）。RIP-seq揭示了1698个潜在的YTHDF1候选靶点，其中93%是mRNA，这些基因在不同的途径中富集（图4J）。有趣的是，来自RNA-seq、m6A-seq和RIP-seq的基因重叠显示，693个由YTHDF1结合的基因被m6A标记，其中647个（93.4%）基因在YTHDF1敲除后没有改变（图4K）。这些结果表明，YTHDF1并不影响其靶点的RNA丰度。此外，功能注释显示，这647个基因参与了包括翻译、mRNA剪接和RNA内稳态在内的多个RNA代谢过程（图4L）。

5.EIF3C是YTHDF1的m6A修改靶点
        为了全面探讨YTHDF1与其靶向转录本之间的直接相互作用，我们进行了eCLIP-seq，鉴定了2343个靶向转录物，这些转录物大部分是mRNAs（图5A）。从eCLIP seq中还鉴定出m6A一致基序GGAC和YTHDF1结合偏好（图5B和5C）。值得注意的是，175个基因被确认为YTHDF1的直接靶点（图5D）。Circos图显示来自RIP-seq或eCLIP-seq的YTHDF1靶向基因被m6A修饰，但是它们的转录在YTHDF1基因敲除后没有改变（图5E），这表明YTHDF1可能调节卵巢癌细胞的翻译而不是RNA丰度。
        接下来，我们分析了175个YTHDF1结合的mRNA中m6A峰和eCLIP峰的分布，其中一些与肿瘤的发生密切相关。我们发现这些转录本中的大多数YTHDF1结合位点，包括EIF3C，与m6A 位点吻合良好（图5F-J）。GO分析显示，YTHDF1结合转录本与翻译调控关系最为密切（图4L）。CLIP qPCR显示，YTHDF1最显著地富集了EIF3C mRNA（图5K）。这些数据表明EIF3C是卵巢癌细胞YTHDF1的直接靶点。

6.YTHDF1调节卵巢癌细胞EIF3C表达及整体翻译输出
        为了证实YTHDF1调节卵巢癌细胞中EIF3C的表达，我们首先检测了EIF3C在YTHDF1缺失时的转录和翻译。正如预期的那样，YTHDF1沉默降低了A2780和SKOV3卵巢癌细胞中EIF3C的蛋白质丰度，而不影响其RNA水平（图6A和B）。然后我们通过基因特异性的m6A分析来评估EIF3C mRNA的m6A修饰状态，观察到EIF3C mRNA显著富集（图6C）。此外，RIP-qPCR证实了A2780和SKOV3卵巢癌细胞中YTHDF1和EIF3C mRNA之间的相互作用（图6D）。
        随着m6A修饰了EIF3C mRNA，我们接下来探究调节EIF3C表达的YTHDF1是否依赖于m6A。结果表明，卵巢癌细胞被YTHDF1宽型（YTHDF1 wt）或YTHDF1 mut结构体转染（图6E）。随后，用抗FLAG抗体和qPCR检测发现，在转染YTHDF1 wt的细胞中，EIF3C mRNA被有效地免疫沉淀，但是YTHDF1突变体和EIF3C mRNA之间的相互作用显著降低（图6F）。Western blot分析显示YTHDF1-wt能够增强EIF3C-wt的表达，而YTHDF1-wt对EIF3C-mut的表达有轻微的影响（图6G）。
        由于EIF3C是蛋白质合成所必需的EIF3复合物的关键亚单位，我们接下来探讨YTHDF1是否能影响卵巢癌细胞的整体翻译输出。结果表明，与对照细胞相比，在EIF3C基因敲除后，合成蛋白质的HPG含量下降。类似地，与对照细胞相比，缺乏YTHDF1的细胞显示出HPG信号下降（图6H），表明YTHDF1可能影响整个蛋白质合成。总之，这些数据表明，YTHDF1通过调节卵巢癌细胞中EIF3C蛋白的表达促进整体蛋白合成。

7.EIF3C在卵巢癌细胞中起致癌作用
        由于EIF3C在卵巢癌细胞中的作用尚不清楚，我们检测了EIF3C的表达水平。与输卵管相比，卵巢癌中EIF3C的蛋白表达显著升高（图7A和B）。为了进一步研究EIF3C在卵巢癌中的作用，我们分析了A2780和SKOV3细胞的细胞表型。两种卵巢癌细胞系中的细胞生长和集落形成能力在EIF3C基因敲除后均明显受到抑制（图7C和D）。此外，EIF3C缺乏也减少了卵巢癌细胞的迁移和侵袭（图7E和F）。这些结果表明EIF3C促进卵巢癌细胞的癌变。
        接下来，我们在YTHDF1缺陷的A2780和SKOV3细胞中过表达了EIF3C，并且在两个细胞系中都恢复了EIF3C的表达（图7G）。YTHDF1基因敲除损伤细胞生长和菌落形成，而EIF3C的过表达可以逆转这种影响（图7H）。在EIF3C过表达后，由YTHDF1缺失抑制的细胞迁移和侵袭被重新建立（图7I和J）。这些结果提示EIF3C是YTHDF1促进卵巢癌进展的关键下游靶点。另外，YTHDF1的蛋白质丰度与EIF3C的表达呈正相关（图7K）。总之，增加YTHDF1的表达通过调节EIF3C的翻译增强了整体蛋白的合成，并促进了卵巢癌细胞的肿瘤发生（图7L）。

结论：
        我们的研究发现，EIF3C是卵巢癌细胞中YTHDF1的直接靶点。YTHDF1以m6A依赖的方式控制EIF3C的翻译，并作为致癌调节因子影响整个蛋白质翻译。因此，靶向YTHDF1可能是卵巢癌治疗的一个有前途的候选方案。