证据证据证据！外泌体circUHRF1抑制自然杀伤细胞功能

    自然杀伤细胞(NK)在天然抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。近年来，NK细胞功能障碍在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中得到证实。然而，NK细胞功能障碍在人HCC中的分子生物学机制尚不清楚。本文部分回答了该问题：HCC来源的外泌体通过诱导NK细胞上TIM-3的表达抑制IFN-γ和TNFα的产生。本文于2020年6月27日发表在《Molecular cancer》期刊上。
技术路线：

主要结果：
1、HCC组织中UHRF1相关circRNA的分析
    UHRF1通常在HCC进展中上调表达，此外，circRNA是pre-mRNAs的反向剪切产物且通常被认为是癌细胞中pre-mRNAs剪切的副产物。一般来说，circRNAs的水平通常与各自的mRNA水平一致，因此，作者检测了UHRF1来源的14种circRNA的表达水平（Fig.1A），其中hsa_circ_0048677 (circUHRF1)的表达最丰富且在HCC中显著上调（Fig.1B）。进一步地，作者发现circUHRF1的表达在癌中显著高于癌旁组织，且circUHRF1高表达的病人具有更大的肿瘤体积，血液中NK细胞含量更低，更多的微血管入侵以及更差的预后（Fig.1C-I）。

图1 circUHRF1在HCC组织中上调表达

2、HCC细胞以外泌体方式分泌circUHRF1
    前人的研究表明可以通过外泌体在细胞间运输，因此，作者猜测circUHRF1可能被HCC细胞转运至其它细胞，为了验证这个猜想，作者从HCC细胞系上清中分离鉴定到外泌体（Fig.A-B）。结果发现circUHRF1在六种HCC细胞系和对应的外泌体中的表达趋势一致，且HCCLM3和SMMC-7721细胞系及其外泌体中的表达显著高于其它细胞系（Fig.C-D）。此外，检测发现circUHRF1存在与血浆中，并且HCC病人中血浆外泌体circUHRF1显著高于健康志愿者，接受肿瘤切除术的病人外泌体circUHRF1含量降低，肿瘤逃逸的病人外泌体circUHRF1含量升高，这些结果说明血浆外泌体circUHRF1主要有HCC细胞产生（Fig.E）。有趣的是，有免疫逃避机制的患者血浆外泌体circUHRF1水平显著升高，外周血NK细胞比例降低（Fig.F）。这表明血浆外泌体circUHRF1可以作为NK细胞相关免疫逃逸的关键分子决定因素。

图2 circUHRF1的表达及特性

3、HCC细胞抑制NK细胞功能通过外泌体circUHRF1
    为了确定HCC细胞的外泌体circUHRF1是否诱导改变异种NK细胞，作者将6个健康供体的NK细胞和HCCLM3和SMMC-7721细胞系以对等比例共培养24小时，结果发现，与单独培养NK细胞相比，共培养后细胞IFN-γ和TNFα的分泌显著受损（Fig.3A-C）。此外，NK细胞和HCCLM3和SMMC-7721细胞系共培养后显著增加了circUHRF1表达，但是这种增加被外泌体抑制剂GW4869抑制（Fig.3D-E）。不仅如此，加入外泌体抑制剂后NK细胞中IFN-γ和TNFα的分泌在是否与HCC细胞共培养的组间没有表现出差异（Fig.3F-G）。此外，circUHRF1沉默后HCCLM3和SMMC-7721细胞外泌体中circUHRF1的表达显著下降，而IFN-γ和TNFα的分泌显著升高（Fig.3H-J）。上述结果表明HCC来源的外泌体circUHRF1损伤NK细胞的功能。

图3 外泌体表达circUHRF1抑制NK细胞的功能

4、在NK细胞中，circUHRF1和miR-449c-5p相互降解
    作者进一步探究circUHRF1在NK-92细胞中可以结合miRNA，通过StarBase v3.0分析，预测到14个潜在的靶miRNAs。使用circUHRF1特异性和NC探针进行体内circUHRF1沉淀，然后检测circUHRF1复合物中14个靶miRNAs的表达。实验发现，复合物中显著富集miR-449c-5p，而其它则少有富集（Fig.4A）。然后，在NK-92细胞中使用anti-AGO2抗体进行RIP实验，结果发现circUHRF1和miR-449c-5p在anti-AGO2抗体中显著富集，这些结果表明circUHRF1可能是miR-449c-5p和AGO2的结合平台（Fig.4B）。为了进一步验证这个结果，进行了生物素标记的miR-449c-5p的pulldown实验，结果表明与NC相比，circUHRF1显著富集（Fig.4C）。荧光素酶实验结果显示，与NC相比，miR-449c-5p显著降低了野生型circUHRF1的荧光素酶活性，但对突变型的没有影响（Fig.4D-E）。有趣的是，circUHRF1的表达水平可以被过表达miR-449c-5p显著抑制，反过来，miR-449c-5p的表达也可以被过表达circUHRF1显著抑制（Fig.4F-G）。这些结果表明circUHRF1和miR-449c-5p相互靶向结合。

图4 circUHRF1抑制miR-449c-5p在NK细胞中的生物学功能

5、circUHRF1上调TIM-3的表达通过抑制miR-449c-5p活性
    通过上述实验结果，作者猜测circUHRF1可能通过miR-449c-5p海绵上调其靶点的水平进而增强HCC病人的免疫逃逸。为了验证这个猜想，作者首先分析了NK细胞中miR-449c-5p靶点的表达水平，包括TIM，然后使用荧光素酶实验进一步验证miR-449c-5p与TIM的结合（Fig.5A-B）。强制表达miR-449c-5p后，TIM的表达显著下降（Fig.5C-D）。此外，circUHRF1的表达与miR-449c-5p的表达负相关，与TIM的表达呈正相关，miR-449c-5p的表达也与TIM的表达呈负相关（Fig.5E-G）。以上研究结果表明circUHRF1/miR-449c5p/TIM-3轴联合作用影响NK细胞的功能。

图5 在NK细胞中，circUHFR1调控miR-449c-5p/ TIM-3通路

6、circUHFR1以NK细胞依赖的方式诱导HCC的进展
    慢病毒载体pLO5-ciRcircUHRF1显著提高了细胞和外泌体中circUHFR1的表达，以及NOD/SCID小鼠模型体内的肺转移结节（Fig.6A-C）。此外，过表达circUHFR1具有肺转移的小鼠体内血浆外泌体circUHFR1的含量显著升高，而NKG2D阳性细胞数量显著下降（Fig.6D-E）。这些结果表明circUHFR1以依赖外泌体和NK细胞的方式促进HCC进展。

图6 circUHRF1以NK细胞依赖的方式诱导免疫逃逸

7、circUHRF1增强HCC对抗PD1治疗的耐药性
    鉴于强制表达circUHRF1抑制NK细胞的功能，所以接下来作者评估过表达circUHRF1是否会进一步阻碍anti-PD1的抗肿瘤作用。作者回顾性分析了30例在免疫治疗前2-36个月行肝切除术并接受抗PD1免疫治疗的复发远处转移(包括肺转移)的HCC患者的资料。6个治疗周期后，评估CT疗效。结果发现3个病人表现部分响应（PR），7个病人表现稳定疾病（SD），20个病人表现进行性疾病。进一步研究发现circUHRF1的表达水平在PD组显著高于SD组和PR组，而NKG2D阳性细胞数量在PD组显著低于SD组和PR组，两者呈现负相关性(Fig. 7A-C)。
    为了进一步评估circUHRF1对anti-PD1治疗耐药的影响，建立了皮下植入circUHRF1敲低的HCCLM3细胞或阴性对照细胞的异种移植模型。结果表明注射circUHRF1敲低的HCCLM3细胞导致小鼠对anti-PD1治疗敏感且总体生存率升高(Fig. 7D-F)。这些结果表明强制表达circUHRF1可能妨碍HCC对anti-PD1治疗的响应，靶向circUHRF1可能是恢复HCC对anti-PD1治疗敏感性的有效方法。

图7 在HCC患者中，高水平的circUHRF1与anti-PD1治疗的耐药性相关

    总之，本文证明HCC来源的外泌体通过诱导NK细胞上TIM-3的表达抑制IFN-γ和TNFα的产生。还报道了肿瘤外泌体通过外泌体circUHRF1抑制NK细胞功能的新机制，为HCC细胞和NK细胞的相互干扰提供了新的证据。
参考文献：
Zhang Peng-Fei., Gao Chao., Huang Xiao-Yong., Lu Jia-Cheng., Guo Xiao-Jun., Shi Guo-Ming., Cai Jia-Bin., Ke Ai-Wu.(2020). Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer, 19(1), 110. doi:10.1186/s12943-020-01222-5