巨噬细胞外泌体在肝癌中研究进展

        肝癌（HCC）是癌症死亡的第二大原因，严重威胁人类健康。肿瘤的发生、进展和转移受肿瘤微环境的影响。巨噬细胞是最常见的免疫细胞，是肿瘤微环境中的重要组成部分。巨噬细胞外泌体在HCC中的研究新进展来了。

研究思路:

结果:
1. 与巨噬细胞共培养后肝癌细胞的侵袭能力增加
        研究浸润性巨噬细胞对肝癌的潜在影响。PMA诱导THP-1细胞中的巨噬细胞，共培养THP-1巨噬细胞与肝癌细胞，M2巨噬细胞标记（CD206，CD163，TGFβ，Arginase-1）增加，肝癌细胞的侵袭能力增加。MTT分析表明巨噬细胞共培养使肝癌细胞的增殖能力下降，因此侵袭能力的增加不是由于增殖能力的增加所致。以上表明，浸润的巨噬细胞可增加肝癌细胞侵袭能力。

2. 浸润性巨噬细胞通过改变AR表达增加肝癌细胞侵袭
        最近研究表明AR可能在改变肝癌进展中起关键作用。分析AR的临床意义，AR 在原发性肿瘤中表达较低，随着肿瘤分期的增加，AR表达减少。共培养后肿瘤细胞中AR表达降低。添加AR-cDNA减少浸润巨噬细胞诱导的肝癌细胞侵袭，而添加AR-shRNA导致肝癌细胞侵袭增加。以上提示：浸润的巨噬细胞可能通过抑制肝癌细胞AR表达来增加肝癌细胞侵袭。

3. 浸润性巨噬细胞通过改变miRNA降低肝癌细胞中AR表达
        共培养导致肝癌细胞中的AR表达减少。检测Cycloheximide处理的肝癌细胞中AR蛋白水平，发现在对照组（非共培养）和共培养组之间没差异。表明巨噬细胞可能通过转录或转录后调控调节肝癌细胞AR mRNA水平。共培养后肝癌细胞中miR-92a-2-5p，miR-3153，miR-589-5p的表达增加，miR-92a-2-5p和miR-3153可逆转共培养对AR的影响以及共培养后肝癌细胞的侵袭能力。这些表明，巨噬细胞可能通过增加miR-92a-2-5p和miR-3153表达降低肝癌细胞AR表达。

4. 巨噬细胞通过外泌体增加miRNA表达
        miRNA可以被外泌体从巨噬细胞转运到邻近肿瘤细胞。巨噬细胞中高表达miR-92a-2-5p和miR-3153，抑制巨噬细胞中两个miRNA，与肝癌细胞共培养，发现可逆转共培养对肝癌细胞的影响。收集M2-型巨噬细胞培养基，加入肝癌细胞中，发现巨噬细胞外泌体导致肝癌细胞中AR表达减少，加入外泌体分泌抑制剂（GW4869），巨噬细胞失去影响癌细胞的能力。转染pLKO-miR-92a-2-5p抑制剂后或pLKO-miR-3153抑制剂，发现巨噬细胞外泌体中miR-92a-2表达降低，表明外泌体可将miR-92a-2-5p从巨噬细胞转运到肝癌细胞。pLKO-miR-92a-2-5p抑制剂逆转巨噬细胞的诱导肝细胞侵袭能力，过表达miR-92a-2-5p后AR表达降低且癌细胞的侵袭能力增加。总之，巨噬细胞通过转运miR-92a-来减少肝癌细胞的AR表达，从而增加肿瘤侵袭能力。

5. miR-92a-2-5p直接靶向AR mRNA的3'UTR改变AR表达
        搜索AR mRNA 3'UTR上的miR-92a-2-5p潜在靶向位点，萤光素酶报告检测以及敲除miR-92a-2-5p验证miR-92a-2-5p直接靶向AR mRNA的3'UTR以抑制其蛋白表达。

6. 巨噬细胞/外泌体/ miR-92a-2-5p / AR轴通过改变PHLPP /p-AKT /β-catenin信号调控肝癌细胞浸润能力
        检测共培养中癌症相关蛋白质的表达，发现β-catenin与AR的变化最一致。原发性肿瘤中β-catenin表达增加，AR可通过转录调控PHLPP, PHLPP可通过去磷酸化灭活AKT，提高前列腺癌的侵袭能力，而p-AKT /β-catenin信号与肿瘤进展有关。共培养后癌细胞中p-AKT表达增加，PHLPP水平降低。改变巨噬细胞中miR-92a-5p表达导致相似的变化，加入AKT或β-catenin抑制剂，巨噬细胞的作用被阻断。以上表明，巨噬细胞/外泌体/ miR-92a-2-5p / AR轴可通过改变PHLPP / p-AKT /β-catenin信号来调节肝癌细胞的侵袭。

7. 临床前研究：利用miR-92a-2-5p抑制剂靶向此信号通路抑制肝癌进展
        构建带有荧光素酶报道基因的癌细胞，pLKO-miR-92a-2-5p抑制剂转染THP-1细胞，共培养细胞后进行异种移植。发现巨噬细胞处理肝细胞组明显快于对照组，添加pLKO-miR-92a-2-5p抑制剂可部分抑制肿瘤生长，SK-HEP-1-Luc和THP-1-pLKO共培养组转移小鼠比其他两组更多，AR表达降低。分析miR-92a-2-5p在TCGA数据库中的HCC临床样品的表达，发现miR-92a在肿瘤中表达增加。HCC患者低miR-92a-2-5p表达的生存时间比高miR-92a-2-5p表达患者长。表明巨噬细胞miR-92a-2-5p改变AR促进肝癌进展。

参考文献：
The miR-92a-2-5p in exosomes from macrophages increases liver cancer cells invasion via altering the AR/PHLPP/p-AKT/β-catenin signaling