microRNA的一种非典型分子机制——维持血管完整性

    MicroRNAs (miRNAs)是多种基因表达的调控因子，对包括动脉粥样硬化在内的人类疾病有着深远的影响，但它们是否能够发挥翻译后功能来控制细胞适应，以及这些非典型特征是否具有病理生理相关性尚不清楚。近期，来自慕尼黑大学心血管预防研究所的Donato Santovito团队发表在Science Translational Medicin上的研究证明miR- 126-5p在高剪切应力和自噬环境下维持内皮完整性。在自噬小泡表面，miR-126-5p结合argonaute-2 (Ago2)后与Mex3a形成复合物，被引导转运至细胞核。在细胞核中，miR-126-5p与Ago2分离，并通过其种子序列与caspase-3结合，阻止caspase二聚并抑制其活性，从而限制细胞凋亡。

技术路线：

研究结果：
1.高剪切应力（HSS）和自噬促进细胞核miR-126-5p的富集
    在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中过表达KLF2（KLF2在动脉内皮细胞中协调大部分由剪切应力诱发的转录程序），显示出pre-miR-126和miR-126-5p表达量增加（图1A）。在具有EC特异性Klf2缺失的Cdh5CreKlf2fl / fl小鼠的主动脉内膜中检测到了较低的miR-126-5p（图1B）。 KLF2过表达和HSS（12 dyne/cm2）增加自噬相关基因（ATG）的转录并促进自噬通量，通过蛋白质而不是转录本水平如微管相关蛋白LC3-I转化为自噬体相关蛋白LC3-II和自噬底物p62的减少来实现（图1C和D）。雷帕霉素对miR-126-5p具有显着的核定位作用（图1F-H）。qPCR证实了雷帕霉素诱导的内源性miR-126-5p的核富集（图1I）。使ATG5和ATG7沉默或使用a/b 输入蛋白抑制剂伊维菌素可防止miR-126-5p核积累（图1J）。用3-甲基腺嘌呤限制自噬降低了KLF2驱动的核miR-126-5p的积累（图1K）。总之，由KLF2或mTOR抑制触发的自噬控制着miR-126链的运输，并通过核转移保留了miR-126-5p。

2.miR-126-5p的核转移需要RNA结合蛋白Mex3a
    雷帕霉素引起AGO2和LC3的核积累，这被伊维菌素阻断（图3A）。 RNA免疫沉淀（IP）证实了miR-126-5p与核AGO2的优先结合（图3B）。在纳米水平上，在雷帕霉素处理的EC中，在外表面而不是在LC3标界的囊腔中可检测到AGO2（图3C）。用胰蛋白酶孵育分离的自噬体可剂量依赖性地降低AGO2的量，但不会降低LC3-II的量，因此进一步支持了AGO2在膜外表面的定位。总之，我们的数据支持这样的概念，即在自噬体表面上AGO2：miR-126-5p复合物会促进核易位。进行了AGO2-IP识别相互作用的蛋白质。尽管两者相邻，在雷帕霉素处理过的细胞的AGO2免疫沉淀物中未检测到LC3，核AGO2导航因子TNRC6A和importin-8也未检测到（图3D），因此排除他们的参与。Co-IP揭示了细胞质和细胞核中AGO2和Mex3a的相互作用，这通过自噬EC的共聚焦显微镜得到了证实（图3D和E）。使用受激发射损耗（STED）纳米显微镜来观察该复合物，证实了AGO2和Mex3a的共定位信号，而LC3信号仅显示邻近性（图3F）。

3.Mex3a优先与miR-126-5p结合
    接下来，证明了Mex3a的RNA结合，这是由两个K同源（KH）域赋予的。核磁共振（NMR）滴定表明异质串联KH结构域与miR-126-5p结合，符合亚微摩尔亲和力（图4A）。表面等离子体共振（SPR）证实全长Mex3a与固定的miR-126-5p具有高亲和力结合（图4B）。为了验证两个KH域如何发生miR-126-5p结合的结构调节，进行了小角度X射线散射（SAXS），以显示自由的KH1和KH2串联域是灵活连接的，类似于线上的珍珠，然而，当它们与miR-126-5p结合时，它们形成了紧凑的结构（图4C）。使用计算机模型估计的结合自由能（BFE）表明5p链比3p链优先结合（图4D），这与NMR滴定的光谱变化减少一致。通过固定的Mex3a上的SPR，等温滴定量热法（ITC）和暴露于核裂解液后miR-126链的pulldown实验证实miR-126-5p的优先结合（图4D）。同样雷帕霉素处理的内皮细胞中核Mex3a的RNA-IP揭示了miR-126-5p的优先富集（图4E）。 SPR显示AGO2：Mex3a相互作用仅在存在miR-126-5p时发生，在固定化或溶液中都表明复合物中三元相互作用的特异结合（图4F和G）。沉默Mex3a消除了雷帕霉素诱导的AGO2和LC3积累（图4H）和EC细胞核中miR-126-5p的富集（图4I）。总之，确定了miR-126-5p：AGO2复合物的核穿梭作用是由Mex3a依赖性过程介导的。

4.核miR-126-5p具有抗凋亡特性
    通过研究短期接触雷帕霉素后miR-126-5p的基因表达变化以及miR-126-5p的功能得失来研究核miR-126-5p转移的转录效应。涉及EC生物学的多个转录物的表达发生了变化，分析了雷帕霉素和miR-126-5p模拟物进行一致调节的那些功能注释（图5A）。对KEGG途径富集的分析揭示了对凋亡相关途径转录谱的主要影响（图5B），所以在蛋白质水平上研究了凋亡介体。 miR-126-5p的过表达仅略微减弱了caspase-3 / 9的表达，但显着降低了caspase-3的活性形式及其底物的裂解，这一作用需要雷帕霉素的存在来诱导miR-126-5p的核转移，并且在miR-126-5p抑制后未观察到（图5C）。通过Mex3a下调阻止miR-126-5p的核富集会增加caspase-3的裂解物（图5D）。通过使miR-126-5p或Mex3a沉默可以防止雷帕霉素处理后EC细胞凋亡的减少（图5E和F）。同样，miR-126-5p沉默会削弱Mex3a过表达介导的抗凋亡作用（图5G）。

5.与caspase-3的直接相互作用传达了miR-126-5p的抗凋亡作用
    抗凋亡作用在雷帕霉素处理后迅速发生，并且在相关介体中发生转录变化，从而推测了miR-126-5p具有抗凋亡特性。因此，测试了与miR-126-5p复合物的潜在相互作用。通过共聚焦显微镜获得的FISH显示了miR-126-5p和caspase-3的共定位信号，特别是在核和核周区域，并且通过Mex3a下调降低了这种共定位（图6A-C）。在雷帕霉素处理或HSS条件下RNA-IP显示出与核caspase-3相关的miR-126-5p显着富集（图6D）。使用雷帕霉素处理的EC核提取物中miR-126-5p的pulldown检测到caspase-3和Mex3a（图6E）。caspase-3与荧光标记的合成miR-126-5p的共定位可通过部分或完全破坏种子序列（Mut1和Mut2）或更广泛的突变（Mut3）来降低（图6F）。加入miR-126-5p后caspase-3甲基信号的实质光谱变化以及加入caspase-3后的RNA信号均表现出两者直接结合（图6G）。为了验证miR-126-5p可以与AGO2解离而与caspase-3结合，对固定的miR-126-5p进行了竞争分析，结果表明caspase-3取代了AGO2与miR-126-5p的结合（图6H）。SPR揭示了miR-126-5p剂量依赖性地破坏了caspase-3p17亚基的二聚化（图6I）。在无细胞试验中，miR-126-5p剂量依赖性地减少重组caspase-3的裂解物，其最大抑制浓度（IC50）与VAD或DEVD的抑制作用相当（图6J），支持miR-126-5p干扰结合口袋和异二聚体的活性位点形成的观点。种子序列突变的miR-126-5p（从Mut1到Mut3），miR-126-3p，let-7a-5p，miR-17-5p和miR-21-5p的计量改变对caspase-3无效（图6J）。总的来说，这些数据表明，在Mex3a引导下的核miR-126-5p与AGO2分离后，可以通过直接抑制caspase-3保护EC不受凋亡的影响。

6.miR-126-5p:Mex3a通路在体内和人类疾病中起作用
    为了研究自噬驱动途径与血管疾病相关的体内证据，通过三维（3D）反褶积免疫荧光分析了易患动脉粥样硬化的Apoe-/-小鼠主动脉中LC3内皮细胞染色模式。 LC3染色在暴露于HSS的区域比LSS的情况更为普遍（图7A和B）。由于脂蛋白会在体外触发EC的自噬，因此分析了高脂饮食（HFD）的作用。HFD持续12周即可显着增加内皮LC3染色（图7A和B）。此外，在LSS区域，相比于在HSS区域中，LC3的核定位并不普遍并且核Ago2 + EC的百分比则较低（图7C-E）。非病变的人颈动脉分叉上游(暴露于HSS)的内皮细胞比分叉下游的动脉粥样硬化区表现出更明显的核AGO2定位（图7F和G）。此外，共聚焦反褶积显微镜揭示了EC核中Mex3a和miR-126-5p的紧密定位信号（图7H）。发现在未患病血管区域的EC中，Mex3a和miR-126-5p之间的相互作用距离比覆盖动脉粥样硬化病变的EC中的距离低，因此反映了更高的相互作用可能性（图7I和J）。
    使用了内皮自噬缺陷的Apoe-/-Cdh5Cre + Atg5fl / fl（ATG5EC-KO）小鼠进行研究。 HFD 12周后，ATG5EC-KO小鼠的LSS和HSS区域胸主动脉中带有核Ago2和miR-126-5p信号的EC的百分比和核miR-126-5p含量均低于对照组（图7K-M）。循环中CD31 +膜联蛋白V + ABs和miR-126-3p浓度增加表明ATG5EC-KO小鼠EC凋亡增加（图7N）。由于凋亡破坏了内皮的完整性以促进动脉粥样硬化的进展，HFD持续12周后，ATG5EC-KO小鼠的动脉粥样硬化负担相应增加（图7O），这是由于HSS区域显著加重所致（图7P）。与ATG5EC-KO小鼠相似，具有Mex3a遗传缺陷的Mex3a-/-小鼠的胸主动脉显示较少的带有核Ago2染色的EC（图7Q），并且原位RNA杂交显示出miR-126-5p + EC的显着减少（图7R和S）。相反，在Mex3a-/-小鼠中，活性形式的caspase-3的核染色增加（图7T）。在人的颈动脉样本中，在非患病区域与动脉粥样硬化区域相比，miR-126-5p和caspase-3的紧密定位信号检出率更高（图7U和V）。总体而言，这些数据支持由内皮自噬驱动的核Ago2：Mex-3a：miR-126-5p途径可在体内发生，以赋予剪切应力依赖性动脉粥样硬化保护作用。

参考文献：
Santovito Donato., Egea Virginia., Bidzhekov Kiril., Natarelli Lucia., Mourão André., Blanchet Xavier., Wichapong Kanin., Aslani Maria., Brunßen Coy., Horckmans Michael., Hristov Michael., Geerlof Arie., Lutgens Esther., Daemen Mat J A P., Hackeng Tilman., Ries Christian., Chavakis Triantafyllos., Morawietz Henning., Naumann Ronald., von Hundelshausen Philipp., Steffens Sabine., Duchêne Johan., Megens Remco T A., Sattler Michael., Weber Christian.(2020). Noncanonical inhibition of caspase-3 by a nuclear microRNA confers endothelial protection by autophagy in atherosclerosis. Sci Transl Med, 12(546), undefined. doi:10.1126/scitranslmed.aaz2294