lncRNA INCR1调节IFNγ信号逃避肿瘤免疫

导读：
        免疫检查点抑制剂治疗是基于肿瘤上调免疫检查点分子（如PD-L1）来逃避抗肿瘤免疫的能力，然而部分应答者对这些疗法出现获得性耐药。免疫检查点抑制剂的耐药部分是由于肿瘤中IFN刺激基因的持续表达，导致持续的IFNγ信号传导。lncRNA转录过程本身可以促进染色质重塑，增强编码基因启动子的活性。研究显示lncRNA的异常表达与肿瘤的发生发展有关，但它们在免疫逃避中的作用仍不清楚。Mineo等人在下面这篇文章中研究了lncRNA INCR1在肿瘤免疫逃避中的作用。

技术路线图：

结果：
1.lncRNA INCR1在IFNγ刺激的肿瘤细胞中表达
        首先对IFNγ刺激的患者源性GBM细胞株(PDGCLs)进行了全转录组分析(RNA测序，Figure 1A)，IFNγ刺激了113个lncRNA的转录，包括已经被验证的IFNγ刺激之后上调的lncRNA BANCR。在上调最显著的lncRNA中，有一个表达于PD-L1/PD-L2位点DNA链的lncRNA特征不明显，命名为lncRNA INCR1(Figure 1B)。INCR1表达与237个lncRNAs表达呈正相关( Figure 1C)，其中几个转录于受IFN调控的编码蛋白质的基因座(Figure 1D)。PhyloCSF对INCR1序列进行分析，结果显示该转录本具有低编码潜力( (Figure 1E))。通过体外转录/翻译实验，文章也证实了INCR1没有被翻译成蛋白( (Figure 1F)。qPCR分析显示，INCR1主要定位在细胞核内(Figure 1G)。分析INCR1位点和附近的9p21细胞带，包括CDKN2A/B基因，在32个PDGCLs和43个长期GBM细胞系(LTGCLs)中，显示了与来自癌症基因组图谱(TCGA)队列的GBM肿瘤相似的拷贝数改变模式，这表明实验中的细胞系模型反映了人类疾病。

2.在不同的癌细胞和病人的肿瘤中，INCR1表达与PD-L1水平相关
        对PDGCLs 进行qPCR分析发现在所有的细胞系中，IFNγ刺激INCR1上调 (Figure 2A)。IFNγ处理的PDGCLs也表达高水平的PD-L1 mRNA和蛋白(Figure 2B)。值得注意的是，我们观察到INCR1和PD-L1 mRNA和蛋白之间高度显著的相关性(Figure 2C)。与这些发现相一致的是，INCR1在患者GBMs中表达与PD-L1 mRNA水平呈正相关，INCR1高的肿瘤也表达较高的PD-L1水平(Figure 2D and 2F)。实验选择6个代表GBM、黑色素瘤、NSCLC和BC的细胞系。IFNγ刺激后，所有细胞系均显示INCR1表达增加(Figure 2G)，这也与PD-L1表达相关(Figures 2H and 2I). 因此，说明文章发现了肿瘤和组织培养细胞中一种新的lncRNA，IFN刺激其表达，其表达与PD-L1呈正相关。

3.INCR1调节肿瘤IFNγ信号通路
        作者推测INCR1会调节其邻近基因的表达和IFNγ刺激引起的肿瘤应答。沉默INCR1降低了938个基因的表达，其中451个基因在未受刺激和IFNγ刺激的细胞中普遍下调(Figure 3A )。基因本体论(GO)富集分析显示下调的基因参与免疫相关功能，如IFNγ应答、先天免疫应答和对病毒的防御应答(Figure 3B)。此外，INCR1基因敲低导致124个ISGs基因表达减少(Figure 3C)。这些基因中包括IFNγ信号通路的重要组成部分(JAK2，STAT1)，以及主要的免疫抑制分子(PD-L1和IDO1)。研究证实，无论是在基础水平上还是在IFNγ作用下，沉默INCR1都会导致其重叠基因PD-L1和PDL2的mRNA水平降低(Figure 3D 3F)。值得注意的是，与INCR1和PD-L1在同一位点的JAK2的mRNA显著下调(Figure 3G)，来自不同基因组区域的ISGs如STAT1和IDO1的mRNA也显著下调(Figure 3H和3I)。此外，文章中证明了沉默INCR1导致PD-L1、JAK2、STAT1和IDO1蛋白水平下调(Figure 3J)。总STAT1的下调与IFNγ刺激下其磷酸化和核定位降低相关(Figure 3J）。此外，我们发现沉默INCR1降低了PD-L1总蛋白和细胞表面PD-L1水平。

4.体外沉默INCR1导致T细胞介导的细胞毒性增加；体内提高CAR-T细胞疗效
        研究表明CD8+ CTLs的激活诱导IFNγ等细胞因子的分泌，促进其增殖和抗肿瘤活性。将肿瘤细胞与CD8 + CTL共培养，用antiCD3和anti-CD28抗体共价偶联的珠子激活，会使INCR1沉默细胞的细胞毒性比对照组增加，但活化T细胞的生存能力没有显著变化(Figure 4A)。使用3D培养系统，我们发现当INCR1敲除肿瘤球与激活的CD8+ ctl共孵养时显著减小，与对照肿瘤球相比(Figure 4B)。这与INCR1沉默细胞共培养的CD8+ CTLs中IFNγ分泌增加有关，与CD8+ CTLs共培养的空白细胞相比。
        将U251-EGFRvIII对照和INCR1沉默肿瘤植入皮下。植入后7天，单独表达GFP的人T细胞(对照组)或EGFRvIII-directed CAR被单次静脉注射为标准剂量的1/10。在这些条件下，对照组肿瘤小鼠对CAR-T细胞治疗没有明显反应。相比之下，CAR-T细胞显著降低了INCR1敲低肿瘤小鼠的肿瘤生长。在研究结束时，也就是注射T细胞后的21天，我们对肿瘤进行了CAR - T细胞存在的分析。INCR1敲除肿瘤同时出现CD4+和CD8+ T细胞浸润，以CD8+ T细胞为主。相比之下，对照组肿瘤未见CD4+ T细胞浸润(Figure 4E，4F)。此外，与INCR1沉默的浸润性肿瘤相比，对照组的CD8+ T细胞表达的PD-1水平明显更高(Figure 4G)。这些结果表明INCR1在控制肿瘤IFNγ信号中发挥着功能作用，其敲除导致人类肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性增加。

5.HNRNPH1是INCR1的结合搭档
        大多数lncrna通过与蛋白质相互作用而发挥作用。为了明确INCR1调控PD-L1表达的机制，我们采用RNA反义纯化(RAP)对IFNγ刺激的PDGCLs中与内源性INCR1直接接触的蛋白进行纯化。我们设计了覆盖整个INCR1序列的探针，通过UV照射交联RNA -蛋白复合物，并在变性条件下进行RAP，以最大限度地恢复特定RNA-蛋白相互作用。与对照纯化相比，我们观察到大于80倍的INCR1 RNA富集((Figure 5A)。质谱分析显示，在INCR1 RAP中，HNRNPH1蛋白结合最高，而在对照RAP中则不是(Figure 5B)。然后，我们通过体内RNA UV交联和免疫沉淀(CLIP)验证了INCR1和HNRNPH1之间的相互作用。此外，与未处理的细胞和同型对照相比，IFNγ刺激的细胞中HNRNPH1与INCR1显著结合(Figure 5C)。为了识别HNRNPH1结合的INCR1区域，我们首先通过增强剪辑测序(eclipseq)绘制了体内HNRNPH1结合位点。我们在INCR1的近端内含子上发现了一簇峰 (Figure 5D)。
        为了在体外验证测序数据，我们克隆了一个包含第一个内含子50和30区域的INCR1小基因，并利用它生成了7个不同的体外转录的生物素化RNA。RNA pull-down分析显示，HNRNPH1与包含在eclipseq中发现的主要峰序列的2个RNA片段(F4和F6)相互作用强烈(Figure 5E)。HNRNPH1结合的两个片段在G-stretches中富集，该基序在80%的HNRNPH1 RNA靶标中被发现(Figure5F)。GO富集分析所有被eCLIP-seq确定的基因，显示HNRNPH1，除了结合到INCR1,也结合到参与免疫系统过程的多个基因，包括几个IFNγ刺激的基因如PD-L1 JAK2和STAT1，它们的表达受INCR1调节(Figure 5G)。接下来，我们通过RNA免疫沉淀(RIP)验证HNRNPH1结合PD-L1和JAK2 mRNA(Figure 5H 5I)。这些结果表明INCR1与HNRNPH1的结合不依赖于PD-L1和JAK2 mRNA的结合。

6. INCR1是HNRNPH1活性的负调控因子
        沉默HNRNPH1可以提高IFNγ处理的A375细胞((Figure 6A)和患者源性BT139细胞的PD-L1和JAK2 mRNA水平。这与IFNγ刺激下PD-L1和JAK2蛋白显著增加有关(Figure 6B)。这些数据提示HNRNPH1是PD-L1和JAK2表达的负调控因子，需要结合INCR1才能阻止HNRNPH1的功能。在GBM肿瘤(TCGA)中，观察到HNRNPH1水平与PD-L1表达呈负相关，支持了这一假设(Figure 6C)。为了进一步证明我们的假设，我们进行了敲低实验来沉默INCR1敲低细胞中HNRNPH1的表达。正如预期的那样，INCR1敲低导致IFNγ处理的细胞中PD-L1表达减少。然而，沉默敲除细胞中的HNRNPH1挽救了PD-L1的表达(Figure 6D)。与PD-L1和JAK2 RNA片段相比，INCR1 RNA片段对HNRNPH1表现出更高的结合亲和力(Figure 6E)。这些数据表明，HNRNPH1与INCR1结合可能会降低其与PD-L1和JAK2相互作用的能力。利用g-32P放射性标记的PD-L1和JAK2 RNA片段，我们观察到RNA:HNRNPH1复合物的位移，证实了这两个序列结合HNRNPH1的能力(Figure 6F)。INCR1:PD-L1和INCR1:JAK2比值为1:1中非标记INCR1 RNA片段的添加有效降低PD-L1:HNRNPH1和JAK2:HNRNPH1复合物的形成(Figure 6F)，表明HNRNPH1与JAK2之间的亲和力弱于HNRNPH1与PD-L1之间的亲和力。将摩尔比增加到1:5和1:10，复合物完全解离(Figure 6F)。这些结果表明INCR1对HNRNPH1的亲和力强于对PD-L1或JAK2，并且INCR1抑制了HNRNPH1与PDL1和JAK2的相互作用。
        通过ASO H1B（靶向INCR1 RNA中HNRNPH1结合位点），我们可以在体外以剂量依赖的方式减少INCR1与HNRNPH1的相互作用(Figure 6G)。然而，使用对照ASO检测未观察到对结合能力的影响(Figure 6G)。为了研究ASO H1B在体内的作用，在ASO转染BT333患者源性细胞和A375黑色素瘤细胞中，ASO H1B均显著降低IFNγ刺激的PD-L1和JAK2蛋白的表达(Figure 6H)。这些结果表明INCR1特异性地与HNRNPH1相互作用，阻断这种相互作用会影响PD-L1和JAK2的表达。