一箭双雕的CircITCH：抑制癌症 减轻阿霉素的心脏毒性
阿霉素(DOX)是目前最有效的抗肿瘤药物之一，但是因为它有严重心脏毒性风险，所以其临床应用受到限制。前人的研究已经确定CircITCH是一种广谱的肿瘤抑制环状RNA，其宿主基因ITCH参与了doxbicin诱导的心脏毒性(DOXIC)。CircITCH是否在DOXIC中起作用还不清楚。本文为解决这一问题提供了部分答案，并于2020年5月11日发表于《Circulation Research》IF：14.467期刊上。
技术路线如下：
本文结果如下：
1、CircRNA在人类DOXIC处理和健康心脏组织中的表达模式
为了筛选潜在的候选circRNA，对3例DOX诱导的心肌病人组织和3里非疾病健康捐赠者的心脏组织进行circRNA表达谱测序。如图1A所示，获得了19112个circRNAs，其中84.93来自与外显子基因组。另外，在两组间差异表达的circRNA有356个，207个在病人中上调，149个下调（Fig. 1B）。对最显著上调的差异circRNA进行PCR数据库验证，发现hsa_circ_0001141，其宿主基因ITCH下调并参与DOXIC，因此，作者初步选定ITCH来源的circRNA。
对5个ITCH来源的circRNAs亚型的验证表明hsa_circ_0001141是仅有的一个富集趋势符合预期的亚型，将其命名为CircITCH。随后验证了其首尾相接的环形结构和大小（Fig. 1C-F）。亚细胞定位显示CircITCH主要分布于细胞质，暗示可能吸附miRNA发挥作用。随后，实验发现DOX处理后CircITCH的表达显著下降（Fig. 1I-K）。这些数据暗示CircITCH在DOXIC中发挥作用。
图1 CircITCH表达模式在DOXIC在人类样本
2、CircITCH过表达减轻了DOX诱导的细胞死亡，收缩功能障碍和钙处理缺陷
随后作者探究了CircITCH在DOX诱导的hiPSC-CMs损伤和功能异常中的作用。为此，使用三种正常的iPSC细胞系和五批基于单分子层的心肌分化方案来生成hiPSC-CM。在hiPSC-CM分化后的30-35天使用CircITCH表达的腺病毒转导至葡萄糖饥饿纯化的hiPSC-CM中，并检测到CircITCH的高表达，而ITCH的表达无变化。同时使用CircITCH-ir没有下游反向序列做对照。将上述构建的细胞暴露于DOX，检测到CircITCH在hiPSC-CMs中过表达可以防止细胞活性丧失(Fig. 2A-D)。CircITCH过表达也能抑制乳酸脱氢酶(LDH)渗漏、心肌细胞坏死指数和EthD1阳性死亡细胞数(Fig. 2B, E-F)。
DOX处理后在hiPSC-CMs细胞中观察到单层的收缩/松弛速度和变形距离显著下降，而CircITCH过表达能显著阻止上述趋势，并且DOX处理的hiPSC-CMs细胞的收缩特性都得到明显改善(Fig. 2G-I)。此外，作者在单细胞水平进行了钙离子成像检测，与上述结果一致，DOX可降低hiPSC-CMs的钙波幅并引起舒张期钙超载，相反的，CircITCH过表达缓和上述改变(Fig. 2J-L)。这些结果证明CircITCH过表达保护免受DOX诱导的hiPSC-CMs细胞损伤和功能异常。
图2 CircITCH减轻了DOXIC在hiPSC-CMs的作用和改善其功能
3、CircITCH过表达可缓解DOX对hiPSC-CMs细胞/线粒体的氧化应激和DNA损伤
为了探究CircITCH引起的心肌保护机制，接下来评估hiPSC-CMs细胞的氧化应激和DNA损伤水平，这是DOXIC相关的两个主要的指标。与此前的报道一致，DOX处理引发DNA双链断裂（DSB），导致γ-H2AX阳性细胞的比例增加(Fig. 3A, C, D)，该结果可通过ATM磷酸化增加证实(Fig. 3 B, E, F)。另一个DNA损伤的指标，8-OHdG泄露，其结果与上述一致(Fig. 3J)。此外，CircITCH过表达可以减缓线粒体DNA损伤(Fig. 3I)。类似的，DOX处理增加了线粒体和细胞的氧化应激，但CircITCH过表达可以部分消除这种反应(Fig. 3 G, H, K)。
图3 CircITCH可缓解DOX对hiPSC-CMs细胞/线粒体的氧化应激和DNA损伤
4、CircITCH保护免受DOXIC通过miR-330-5p
通过对RegRNA 2.0和CircInteractome的预测结果进行重叠获得了8个CircITCH潜在的靶向miRNA (Fig. 4A)。生物素标记的CircITCH探针pull-down实验，检测到miR-330-5p, miR-214-3p, miR-7-5p, 和miR-1296的显著富集(Fig. 4B-E)。荧光素酶实验发现miR-330-5p最能显著改变荧光素酶活性。此外，生物素偶联miR-330-5p比生物素偶联突变体探针捕获更多CircITCH (Fig. 4 F, G)，FISH显示CircITCH和miR330-5p存在共定位(Fig. 4H)。这些结果验证了miR330-5p可以在hiPSC-CMs中与CircITCH结合。
图4 CircITCH在hiPSC-CMs中起着内源性miR-330-5p海绵的作用
5、MiR-330-5p在dox处理的hiPSC-CMs中上调，其沉默可防止DOXIC
如图Fig. 5A所示，DOX处理后miR-330-5p的表达显著上调。因此，随后进行了miR-330-5p的抑制实验，结果表明，抑制miR-330-5p后细胞活力增强，细胞死亡减少，LDH泄露降低，改善hiPSC-CMs的收缩和舒张速度，提高钙波幅，降低舒张期钙超载，减弱细胞和线粒体DNA损伤，抑制细胞和线粒体氧化应激，其效果与CircITCH过表达一致(Fig. 5B-M)。这些结果表明抑制miR-330-5p可以显著抑制hiPSC-CMs中的DOXIC。
图5 MiR-330-5p在dox处理的hiPSC-CMs中上调，其沉默可防止DOXIC
6、在DOX暴露的hiPSC-CMs细胞中，SIRT6、BIRC5和ATP2A2直接靶向miR-330-5p，并受到CircITCH/miR-330- 5p轴调控
如图6A所示，GSE数据库GSE79413, GSE64476, 和GSE97642这三个数据库重叠的组合识别出84个miR-330- 5p的候选靶标。随后通过PCR芯片，鉴定miR-330- 5p下调靶基因和DOX处理下调靶基因的重合基因，得到三个候选目标分子SIRT6、BIRC5和ATP2A2，随后进行荧光素酶报告基因验证，发现miR-330- 5p可以有效降低上述三个报告载体的荧光活性，而结合位点突变后荧光素酶活性没有显著改变，证明三个分子与miR-330- 5p具有结合作用(Fig. 6C-E)。
图6 在DOX处理的hiPSC-CMs中，miR-330-5p直接作用于SIRT6、BIRC5和ATP2A2
7、CircITCH改善小鼠DOXIC
为了在体内进一步验证CircITCH是否参与DOXIC调节，使用AAV9载体系统在小鼠中过表达CircITCH。过表达效率如图7B所示。在急性小鼠模型中，HE染色观察到CircITCH的过表达减少了DOX诱导的心室组织广泛空泡化(Fig. 7C, D)。提示心肌损伤的心肌酶研究显示，CircITCH过表达有效地降低了DOX诱导的血清天冬氨酸转氨酶(AST)、LDH和肌酸激酶(肌/脑)水平(Fig. 7E-G)。此外，功能性心肌研究显示，包括超声心动图和侵入性血流动力学方法，证明CircITCH过表达显著提高了由阿霉素诱导降低的左心室射血分数(LVEF)、左心室部分缩短(LVFS)，左心室收缩末期和舒张末期压力(LVESP)和一阶导数的LV压力，但过表达降低了DOX引起的左心室舒张末期压力(LVEDP)的升高(Fig. 7H-O)。这些结果表明CircITCH在小鼠体内同样具有保护免受DOXIC伤害的作用。
图7 AAV9介导的CircITCH过表达可改善小鼠DOXIC
总之，如图8所示，CircITCH发挥其潜在功能，作为ceRNA来吸附miR-330-5p，从而激活miR-330-5p靶标SIRT6，BIRC5（Survivin）和ATP2A2（SERCA2a），从而通过改善DOXIC通过减少氧化压力和DNA损伤，细胞死亡，收缩功能障碍和钙处理缺陷。
此外，CircITCH被证实是各种实体瘤中的抑癌剂（右上）。 因此，本文揭示了CircITCH在DOXIC进展中的新作用，并将其确定为促进基于阿霉素的化学疗法的有希望的治疗剂。 因此，CircITCH具有一箭双雕的作用，即增强肿瘤抑制作用，同时降低化学疗法的心脏毒性。
图8 假设示意图
参考文献：
Han Dong., Wang Yongjun., Zhang Jibin., Dai Xinchun., Zhou Tingwen., Chen Jiangwei., Tao Bo., Wang Yabin., Cao Feng.(2020). The Tumor-Suppressive Human Circular RNA CircITCH Sponges miR-330-5p to Ameliorate Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity Through Upregulating SIRT6, Survivin, and SERCA2a. Circ. Res., undefined(undefined), undefined. doi:10.1161/CIRCRESAHA.119.316061