缺氧诱导的外泌体circRNA与结直肠癌的研究
缺氧是实体瘤的重要特性之一，低氧癌细胞和相对常氧的癌细胞之间存在转移潜能的差异。环状RNA（circRNA）是一种通过选择性剪接形成的内源性RNA，可以稳定地富集在外泌体中，外泌体circRNA（exo-circRNA）是在癌症之间进行信息沟通的媒体。exo-circRNA与结直肠癌的研究值得关注。
技术路线：
结果：
1. 氧气供应的异质性影响细胞膜上E-钙粘着蛋白的分布
癌细胞大致分为两组，即低氧癌细胞和常氧癌细胞。E-钙粘蛋白（E-cadherin）在结直肠癌（CRC）细胞膜上的分布普遍呈下降趋势，且在常氧癌细胞中比低氧细胞分布少。与缺氧外泌体共培养的常氧细胞跨膜的E-cadherin减少，细胞迁移能力增加。表明缺氧性外泌体可能确实携带促转移信号至常氧癌细胞。缺氧外泌体处理的常氧细胞中GEF-H1 / RhoA的表达增加，下游RhoA活性相应地增加。这些结果揭示低氧外泌体刺激的常氧细胞有转移潜能。
2. MiR-133a直接靶向GEF-H1和RhoA
生物信息学分析GEF-H1 mRNA和RhoA mRNA的3'-UTR均可由miR-133a直接靶向。萤光素酶测定发现miR-133a模拟物降低荧光素酶活性，miR-133a抑制剂增加活性。miR-133a模拟物和抑制剂不影响GEF-H1和RhoA的mRNA含量，改变蛋白水平，证实miR-133a负调控GEF-H1和RhoA的转录后表达。
3. circ-133和miR-133a相互作用
分离CRC患者和正常人的血浆外泌体，检测到外泌体标志物Tsg101和CD63。CRC和NC血浆的外泌体circRNAs的差异表达，三个circRNA明显上调，其中has_circ_0010522（circ-133）上调丰度最高，并且预期包含至少10个miR-133a结合位点。miR-133a-生物素捕获更多的circ-133，荧光素酶证实circ-133和miR-133a之间的相互作用。CRC患者的血浆外泌体中circ-133的表达明显增加，而miR-133a减少。随着肿瘤疾病的发展，circ-133表达逐渐升高，而miR-133a的水平降低。circ-133在CRC组织和细胞系中过表达。来自缺氧细胞外泌体富含Circ-133，随着缺氧时间的延长逐渐增加。
4. 缺氧性外泌体circ-133孵育正常细胞
提取的外泌体处理在常氧培养中的SW 480和HCT 116细胞，外泌体的PKH26染色确认外泌体可以成功融入受体细胞。circ-133在低氧外泌体培养的细胞中增加，而在低氧si-circ-133外泌体处理组减少，GEF-H1mRNA和RhoA mRNA水平几乎保持恒定。低氧外泌体处理组中E-cadherin降低，而GEF-H1和RhoA的表达增加。低氧外泌体中敲低irc-133，以上变化减弱甚至消失。低氧外泌体治疗组RhoA激活增加，低氧si-circ-133外泌体中激活受阻。
5. 缺氧性外泌体circ-133通过靶向GEF-H1 / RhoA促进肿瘤转移
细胞用低氧外泌体处理，其运动、迁移侵袭能力增强，但消除缺氧性外泌体的circ-133后这种现象消失。缺氧性外泌体来源的circ-133减少了E-cadherin在细胞膜上的分布。
6. circ-133通过miR-133a / GEF-H1 / RhoA轴促进细胞迁移
细胞过表达circ-133后运动、迁移侵袭增强，而si-circ-133组减少。细胞中circ-133的水平与E-cadherin膜分布负相关。过表达circ-133细胞中GEF-H1和RhoA上调，E-cadherin减少。以上结果表明，缺氧细胞源性外泌体circ-133转入常氧细胞，然后通过吸附miR-133a靶向GEF-H1 / RhoA，从而减少E-cadherin在细胞膜上的分布，增强癌症的迁移能力。
7. 体内实验证实低氧驱动的circ-133 / GEF-H1 / RhoA轴促进肿瘤进展
HCT116细胞皮下接种到SCID小鼠中，Exosomal-OE.circ-133或Exosomal-KD.circ-133每三天注射一次到尾静脉，检测小鼠体重和肿瘤生长。发现
OE.circ-133和OE.circ-133- KD-GEF-H1小鼠血浆外泌体和异种移植组织中circ-133明显增加，而在KD.circ-133组下降。OE.circ-133组和OE.GEF-H1组CTC数明显增加，下调circ-133后CTC数相应减少。OE.circ-133组E-cadherin膜分布减少，circ-133 / GEF-H1 / RhoA轴被抑制分布恢复。总而言之，低氧外泌体circ-133可通过GEF-H1 / RhoA轴促进癌症转移。
