TCGA+TIMER帮你写出肿瘤免疫好文章

    乳腺癌患者的预后与免疫细胞的浸润和lncRNA的表达密切相关。东南大学医学院病理与病理生理学系，Shen Yong等人2020年5月发表在Genomics的一篇文章“Identification and validation of immune-related lncRNA prognostic signature for breast cancer” 影响因子：6.205。 该文通过将ssGSEA应用于这些样品的转录组，评估了从TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov)获得的1109个乳腺癌样品中免疫细胞的浸润，从而产生了高免疫细胞浸润组和低免疫细胞浸润组。为了探讨预后签名在临床应用中的可行性，作者使用单变量和多变量COX分析以及将乳腺癌的预后标志与乳腺癌患者的临床指标（例如性别，年龄，病理分期等）进行了比较。 ROC分析，并确认11个lncRNA预后标志物可能是乳腺癌患者的独立预后因素。TIMER数据库显示，这11个lncRNA对乳腺癌的预后特征与免疫细胞亚型的浸润有关。

结果:
1. 乳腺癌分组的构建和验证
    作者从TCGA获得了1109个乳腺癌样品和113个癌旁样品。将ssGSEA方法应用于乳腺癌样品的转录组，以评估免疫细胞的浸润。包括二十四个与免疫相关的术语，以消除乳腺癌中多种免疫细胞类型的丰富性。通过使用无监督分层聚类算法，根据免疫浸润将乳腺癌样本分为两组，包括高免疫细胞浸润组（n = 943）和低免疫细胞浸润组（n = 166）（图1a）。为了验证上述分组策略的可行性，基于乳腺癌的表达谱，使用ESTIMATE算法来计算肿瘤纯度，ESTIMATE评分，免疫评分和基质评分。与低免疫细胞浸润组相比，高免疫细胞浸润组的肿瘤纯度较低，但估计得分，免疫得分和基质分数更高。高免疫细胞浸润组（Immunity-H）与ESTIMATE评分，免疫评分和基质基质分数（Strromal Score）呈显着正相关，而低免疫细胞浸润组（Immunity-H）与阳性免疫组之间呈显着正相关）和肿瘤纯度（图1b）。与低免疫细胞浸润组相比，高免疫细胞浸润组具有更高的免疫成分和更低的肿瘤纯度（p <.05）。此外，作者发现高免疫细胞浸润组中HLA家族和CD274（PD-L1）的表达分别显着高于低免疫细胞浸润组中的表达（p <0.01）（图1c和d）。此外，作者使用CIBERSORT方法验证了上述各组，发现高免疫细胞浸润组的免疫细胞种类更多（图1e）。总的来说，该乳腺癌分组可用于随访分析。

图1.乳腺癌分组的构建和验证

2. 肿瘤组与癌旁组织，高免疫细胞浸润组与低免疫细胞浸润组之间lncRNA差异表达的分析
    根据| log2FC |> 1，FDR <0.05的标准，作者分析了乳腺癌组（1109例）和乳腺癌癌旁组（113例）之间的差异，发现了2999个差异表达的lncRNA，其中2208和791分别被上调和下调（图2a）。根据相同的标准，与低免疫细胞浸润组相比，高免疫细胞浸润组中鉴定了1422个差异表达的lncRNA，其中455个上调而967个下调（图2b）。经过双向Venn分析，与癌旁癌和低免疫细胞浸润组相比，在肿瘤组和高免疫细胞浸润组中共检测到696个差异表达的lncRNA（图2c）。总之，这些结果表明在乳腺癌组织中存在与免疫相关的lncRNA。

图2.差异表达lncRNA的分析

3. 乳腺癌11种与免疫相关的lncRNA预后标志的鉴定和评估
    基于乳腺癌样本的生存数据集，作者将对696个lncRNA的表达谱应用单变量Cox回归。按照p <0.001的标准，总共确定了18个差异表达的lncRNA（图3a）。为了避免过度拟合预后标志，作者对这些lncRNA进行了Lasso回归分析，发现了17个差异表达的lncRNA与乳腺癌免疫细胞浸润相关（图3b），通过10轮全面交叉验证确定惩罚参数的最佳值（图3c）。通过逐步多重Cox回归分析，得到11种lncRNA，包括LINC00668，LINC02418，AL356515.1，LINC01010，AP005131.6，AL772337.1，AC027514.1，AL161646.2，AC004847.1，AC243773.2和AL591686.1。从以上17种lncRNA中进一步鉴定（表1）。然后根据这11个lncRNA的表达水平计算每个样品的风险评分。风险评分= 0.06 * LINC00668 + 0.13 * LINC02418 + 0.24 * AL356515.1–0.23 * LINC01010–0.15 * AP005131.6 + 0.18 * AL772337.1 + 0.21 * AC0-27514.1 + 0.17 * AL161646.2–0.13 * AC004847.1 + 0.07 * AC243773.2–0.13 * AL591686.1。根据中位风险评分，将乳腺癌样本分为高风险组和低风险组。 Kaplan-Meier曲线显示，高风险组的样本表现出比低风险组更差的总生存（OS），表明风险评分的预后特征是有效的（图3d）。生成风险曲线和散点图以显示每个乳腺癌样本的风险评分和生存状态。高风险组样本的风险系数和死亡率高于低风险组（图3e和f）。在乳腺癌样品中这11个lncRNA表达谱的热图显示，在低风险组中LINC01010，AP005131.6，AC004847.1和AL591686.1高表达，而LINC00668，LINC02418，AL356515.1，AC027514.1 ，AL772337.1，AL161646.2和AC243773.2在高风险组中高表达（图3g）。这些研究共同确定了11种与免疫相关的lncRNA作为乳腺癌的预后标志。

图3.乳腺癌免疫相关lncRNA预后标志的鉴定和评估

4. 评估11种与免疫相关的lncRNAs作为乳腺癌患者独立预后因素的评估
    单因素和多因素Cox回归分析用于探讨上述11种免疫相关的lncRNA是否是乳腺癌的预后因素，而与临床病理因素（例如年龄，性别和病理阶段）无关。单变量Cox回归分析的风险评分和95％CI的风险比（HR）分别为1.328和1.256–1.404（p <0.001），多变量Cox回归分析的风险比（p <0.001），表明11个lncRNA是乳腺癌患者的独立预后因素（图4a和b）。为了比较风险评分对乳腺癌患者预后的敏感性和特异性，进行了时间依赖性受体工作特征（ROC）分析。风险评分的ROC曲线下面积（AUC）为0.836（图4c），表明11种lncRNA对乳腺癌的预后特征是高度可靠的。总的来说，11种免疫相关的lncRNA是乳腺癌患者的独立预后因素。

图4. Cox回归分析用于评估风险评分的独立预后价值

5 乳腺癌的11种与免疫相关的lncRNA预后信号与免疫细胞亚型浸润的相关性
    鉴于这11种lncRNA与肿瘤免疫力相关，作者接下来使用TIMER数据库 (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中的数据分析了11种lncRNA预后标记与乳腺癌免疫细胞亚型浸润之间的相关性。风险评分为B细胞，CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，DC，嗜中性粒细胞和巨噬细胞的相关值为-0.111，-0.205，-0.169，-0.208，-0.204和-0.097，分别表明这些免疫细胞亚型的浸润与乳腺癌的预后显着负相关（图5a-f）。综上所述，乳腺癌的11种lncRNA预后标志与这些免疫细胞亚型的浸润有关。

图5.乳腺癌的11种lncRNA预后特征与免疫细胞亚型浸润之间的相关性

    风险评分与免疫细胞浸润ssGSEA评分的六个最显着相关性。 a. B细胞。 b. CD4 + T细胞。 c. CD8 + T细胞。 d. 树突状。 e. 中性粒细胞。 f. 巨噬细胞。
结论：
    总之，这些研究确定了11种lncRNA作为乳腺癌的预后标志。乳腺癌的11种lncRNA预后特征与免疫细胞亚型的浸润有关。
参考文献：
Shen Yong, Peng Xiaowei, Shen Chuanlu, Identification and validation of immune-related lncRNA prognostic signature for breast cancer.[J] .Genomics, 2020, 112: 2640-2646.