核miRNA抑制TFEB介导的自噬

    溶酶体是至关重要的细胞器，负责降解蛋白质和受损细胞器以维持细胞稳态。转录因子EB（TFEB）是调节溶酶体生物发生和自噬的主要转录因子。TFEB在细胞核中的功能是精细调节的，MiRNA是否参与TFEB的精密调节功能，今日揭晓答案。

技术路线:

结果:
1. 筛选与CLEAR结合的候选miRNA
    为调查核miRNA是否调节TFEB依赖的转录调节，将来自HEK293细胞的核RNA与含有TFEB的结合基序-CLEAR元素的DNA片段共孵育，通过下拉测定，TFEB与CLEAR元素结合。RNA测序检测下拉的核miRNA，并结合荧光素酶报告基因鉴定出miR-30b-5p使CLEAR荧光素酶报告基因活性减少46％，在溶酶体生物发生基因的启动子上观察到与miR-30b-5p互补的基序。通过FRET分析验证miR-30b-5p和CTSD基因的DNA启动子片段之间的直接互动。总而言之，新型miRNA miR-30b-5p可以与CLEAR结合，抑制转录激活。

2. MiR-30b-5p抑制含有CLEAR元素基因的反式激活
    FISH检测显示miR-30b-5p位于细胞质和核。在miR-30b-5p敲除HEK293细胞中，TFEB在CLCN7，MCOLN1，CTSD和GLA 4个基因启动子片段上的富集增加，含有CLEAR元素的基因（例如CTSA，CTSD，MCOLN1和LAMP2）的活性在miR-30b-5p转染的细胞中减少，含有CLEAR元素的基因的mRNA水平在转染miR-30b-5p细胞中显著降低。si-Importin8介导成熟miRNA的细胞质至细胞核转运，导致核miR-30b-5p水平降低88％和miR-30b-5p对上述基因mRNA表达的抑制作用消失。这些结果证实miR-30b-5p抑制了细胞核中含CLEAR元件基因的转录激活。

3. 过表达miR-30b-5p抑制溶酶体生物发生与自噬
    TFEB是调节溶酶体生物发生和自噬的主要转录因子。转染miR-30b-5p的HEK293细胞中溶酶体发生相关基因的表达被抑制，miR-30b-5p能减少营养剥夺或Torin1处理的溶酶体基因蛋白质水平的增加。miR-30b-5p降低了经典的溶酶体标记基因LAMP1和Lysotracker的荧光强度。这些结果表明过表达miR-30b-5p抑制了溶酶体的生物发生。溶酶体生物发生是自噬溶酶体途径中不可缺少的一个过程，TFEB也调节自噬相关基因的表达。与巴氟霉素A1共处理，miR-30b-5p转染的细胞LC3-II水平降低，miR-30b-5p可抑制自噬体和溶酶体的融合。以上表明miR-30b-5p抑制了自噬体的生物发生，以及自噬体-溶酶体融合。

4. 敲除内源性miR-30b-5p升高溶酶体生物发生和自噬
    溶酶体生物发生和自噬基因的蛋白质水平在miR-30b-5p基因敲除HEK293中上调，与EBSS或Bafilomycin A1共使用时，上述基因的增加更为显著。LAMP1和Lysotracker以及串联EGFP-mCherry-LC3探针证实了内源性miR-30b-5p和自噬溶酶体过程之间的关系。

5. miR-30b-5p对溶酶体过程和自噬的抑制作用依赖TFEB
    Mut-miR-30b-5p（CLEAR的潜在结合位点被突变）逆转了miR-30b-5p对TFEB转录活性的抑制作用。此外，溶酶体和自噬相关基因的mRNA和蛋白质水平不受Mut-miR-30b-5p影响。miR-30b-5p过表达细胞中，抑制TFEB挽救了溶酶体和自噬相关基因的萤光素酶活性和mRNA水平的降低，TFEB的过表达可以部分挽救miR-30b-5p的上述抑制作用。这些数据表明，TFEB对miR-30b-5p介导的溶酶体生物和自噬的抑制是必不可少的。

6. miR-30b-5p对小鼠肝脏自噬溶酶体过程的调控
    进一步探索miR-30b-5p在体内的功能，通过尾静脉将重组腺病毒注射到小鼠中，禁食48小时以诱导小鼠肝脏中溶酶体生物发生和自噬，在肝脏中证实过表达成熟的miR-30b-5p，导致TFEB和溶酶体生物发生基因的启动子pol II的富集减少，LAMP1和LC3-II蛋白降低，SQSTM1 / p62蛋白增加。这些结果显示miR-30b-5p抑制了饥饿引起的自噬溶酶体过程。