不同寻常的思路——miR455-3p联合m6A修饰发高分
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-11-20
已经知道热休克转录因子1(HSF1)过表达会促进谷氨酰胺分解并激活结直肠癌(CRC)中的mTOR...

    已经知道热休克转录因子1(HSF1)过表达会促进谷氨酰胺分解并激活结直肠癌(CRC)中的mTOR。然而,HSF1的癌症特异性过表达的机制仍不清楚。本文在此背景下对该机制进行了解答,发现了β-catenin抑制miR455-3p表达随后刺激HSF1 mRNAm6A修饰并促进其在结直肠癌中的翻译过程。本文于2020年8月24发表在《Molecular Cancer》IF:15.302杂志上。

研究结果:
1、β-catenin在CRC中激活HSF1
    为了探究HSF1的潜在调控,筛选了具有敲除HSF1后类似效果的药物,如图1A所示,其中有文献报道pyrvinium可以抑制HSF表达达到类似敲除的效果。此外,WNT/β-catenin信号通路特征与HSF1正相关(图1B)。事实证明,pyrvinium减弱了HSF1结合驱动的荧光素酶的活性,并降低了已知由HSF1靶向调控的基因的表达和结合,如HSP90AA1, HSPA4,HSPB1, and HSPH1 (图1D和E)。与pyrvinium一致,敲除β-catenin降低了HSF1的活性和其靶向的基因的表达,以及减弱HSF1与靶基因的结合能力(图1F, G, I)。在结直肠癌细胞系RKO中,β-catenin表达水平较低,且GSK3抑制剂LiCl可以上调HSF1靶基因表达(图1h)。
    为了探讨HSF1激活与β-catenin信号通路的生物学相关性,分析了LiCl处理前后野生型小鼠胚胎成纤维细胞(WT MEF)和HSF1敲除MEF (HSF1 KO MEF)的基因表达(NCBI GEO: GSE151119)。LiCl处理的HSF1 KO MEF中只有750个基因上调,而LiCl处理后WT MEF中有1435个基因显著上调(图1j)。其中,有875个基因表现出对HSF1的依赖,一旦HSF1缺失,LiCl处理后其表达水平没有上调(图1k)。事实上,它们的表达水平与先前报道的HSF1的表达水平有高度相关性(图1l)。综上所述,这些结果表明,β-catenin可以正向调控HSF1。

图1 WNT/β-catenin信号通路激活HSF1

2、β-catenin促进HSF1蛋白的翻译
    如图2a和b所示,pyrvinium and β-catenin敲除均降低了HSF1蛋白水平。相反,外源性的过表达β-catenin增加了HSF1蛋白水平(图2c)。此外,在RKO和MEF细胞中,LiCl处理激活WNT/ catenin信号后,HSF1蛋白水平均升高(图2d)。HSF1的表达与原代组织中的β-catenin表达有很好的相关性(图2e和f)。这些数据表明,β-catenin上调HSF1蛋白表达。嘌呤霉素标记法监测新生HSF1蛋白的合成,结果显示缺失降低了HSF1的嘌呤霉素标记(图2g),蔗糖梯度离心法的结果显示β-catenin缺失显著减少了多聚体部分HSF1 mRNA的存在,但增加了非翻译核糖体部分(图2h)。综上所述,β-catenin是通过刺激HSF1蛋白翻译上调HSF1表达。

图2 β-catenin促进HSF1蛋白的翻译

3、HSF1蛋白翻译受miR455-3p调控
    数据库分析挖掘到两个潜在的可以与HSF1结合的miRNA,miR455-3p和miR214-5p(图3A)。此外,它两都可以降低HSF1的蛋白表达,更重要的是,miR455-3p的抑制剂而不是miR214-5p挽救了由β-catenin敲低引起的HSF1蛋白的下调(图3B-C)。一致的,miR455-3p抑制了HSF1驱动的荧光素酶活性,并且HSF1在miR455-3p标记的探针中显著富集,提示两者之间的结合关系(图3D-E)。miR455-3p在肿瘤中下调表达,其表达与HSF1呈负相关(图3F-G)。此外,miR455-3p过表达抑制了CRC细胞的增殖,促进其凋亡(图3H-J)总之,上述结果表明miR455-3p靶向HSF1 mRNA 3 ' -UTR抑制其翻译。

图3 HSF1蛋白翻译受miR455-3p调控

4、HSF1 mRNA m6A修饰刺激其蛋白翻译
    除microRNA外,mRNA修饰(例如N6-甲基腺苷(m6A))在HSF1翻译调控中也起着重要作用。作者注意到HSF1 mRNA 3'-UTR中miR455-3p种子序列的匹配位点包含m6A修饰的典型基序(图4a),这得到了生物信息学分析的支持(图4b)。meRIP后的PCR分析(m6A RNA免疫沉淀)进一步证实了m6A修饰的HSF1 mRNA(图4c)。更重要的是,在HSF1 mRNA 3 -UTR突变体不能结合miR455-3p,但保留了m6A修饰位点DRACH的载体的荧光素酶活性均高于野生型 (图3d),说明METTL3也与HSF1 mRNA结,并且m6A修饰对HSF1表达很重要性。抑制METTL3,HSF1 mRNA的m6A修饰就会减少,HSF1 mRNA m6A修饰的这种减少降低了HSF1蛋白的表达和新生的HSF1蛋白的合成(图4e-g)。此外,METTL3耗竭显着减少了多核糖体部分中HSF1 mRNA的存在,但在非翻译核糖体部分中增加了(图4h),而HSF1 mRNA或HSF1蛋白的稳定性没有改变。YTHDF1是HSF1 m6A修饰的读取蛋白,随着YTHDF1的敲低,HSF1蛋白降低,(图4i)。综上所述,HSF1 mRNA的m6A修饰与刺激其翻译有关。

图4 HSF1 mRNA m6A修饰刺激其蛋白翻译

5、β-catenin抑制miR455-3p从而增加HSF1 mRNA的m6A修饰
    随后,作者探究了miR455-3p与HSF1 mRNA m6A修饰的相互作用,野生型miR455-3p的过表达降低了HSF1 mRNA m6A修饰及其与METTL3的结合,但miR455-3p突变体不能与HSF1 mRNA结合(图5a)。METTL3缺失不仅降低了m6A对HSF1 mRNA的修饰(图4e),而且增强了miR455-3p与HSF1 mRNA的相互作用(图5b),这些结果表明miR455-3p可能与METTL3竞争HSF1 mRNA的m6A修饰,从而抑制HSF1蛋白的翻译。
    miR455-3p抑制剂挽救了由β-catenin缺失引起的HSF1 mRNA m6A修饰的减少,同时METTL3与HSF1 mRNA的相互作用也因β-catenin缺失而废除,伴随的是miR455-3p与HSF1 mRNA的相互作用增强,以及成熟前体和初级miR455-3p表达上调(图5C-F)。相比之下,当过表达或LiCl处理上调后,成熟miR455-3p和初级miR455-3p均下调(图5F-G)。
    初级miR455-3p来源于COL27A1内含子10中编码的一个pre-miRNA发夹结构,并且COL27A1的表达与miR455-3p的表达显著正相关(图5h)。敲除β-catenin后COL27A1的表达显著上调,此外β-catenin/TCF7L2复合物可以与COL27A1的启动子相互作用,同时β-catenin的表达与COL27A1呈负相关(图I-K)。因此,β-catenin通过抑制miR455-3p的表达,促进HSF1 mRNA由miR455-3p结合向m6A修饰的转变,最终促进HSF1蛋白的翻译。

图5 β-catenin抑制miR455-3p从而增加HSF1 mRNA的m6A修饰

6、HSF1基因和化学抑制均可减轻小鼠的结直肠癌
    根据体外研究结果,鉴于小鼠中miR455-3p和HSF1 mRNA的相互作用似乎是非常保守的(小鼠miR455-3p种子序列:CAGUCCA;小鼠HSF1 mRNA 3'-UTR中的结合位点:tggactg),进一步探讨了HSF1在Apcmin / +和Apcmin / + 和HSF1 +/-小鼠结直肠癌发生的作用。与正常C57BL / 6相比,Apcmin / +小鼠肠道组织中HSF1及其下游靶标GLS1的表达增加,而miR455-3p的表达减少(图6a和b)。用高脂饮食喂养3个月后,这些Apcmin / +小鼠的肠内出现了多个肿瘤(图6c)。然而,用HSF1的化学抑制剂KNK437处理的Apcmin / +小鼠中和和Apcmin / + HSF1 +/-的小鼠肿瘤大小和数量均显着减少(图6d),同时伴随着HSF1靶点的表达下调(图6e)。这些结果证实,HSF1是WNT /β-catenin信号传导的新型下游靶标,对促进CRC的发展具有重要意义。

图6 通过激活Wnt信号通路,基因和化学抑制HSF1均可减少结直肠癌的发生

    总之,本文揭示:当Wnt /β-catenin失活时,miR455-3p(miR455HG)的宿主基因COL27A1的转录增加,从而产生更多的miR455-3p来占据HSF1 mRNA 3'-UTR并阻止其受METTL3介导 m6A修饰,因此抑制了HSF1翻译。相反,在Wnt /β-catenin激活后,miR455-3p的生成受到抑制,因此HSF1 mRNA可用于METTL3结合和m6A修饰,最终刺激HSF1翻译以促进结直肠癌发生(图6F)。
参考文献:

Song Ping., Feng Lifeng., Li Jiaqiu., Dai Dongjun., Zhu Liyuan., Wang Chaoqun., Li Jingyi., Li Ling., Zhou Qiyin., Shi Rongkai., Wang Xian., Jin Hongchuan.(2020). β-catenin represses miR455-3p to stimulate m6A modification of HSF1 mRNA and promote its translation in colorectal cancer. Mol. Cancer, 19(1), 129. doi:10.1186/s12943-020-01244-z