不同寻常的思路——miR455-3p联合m6A修饰发高分

    已经知道热休克转录因子1（HSF1）过表达会促进谷氨酰胺分解并激活结直肠癌（CRC）中的mTOR。然而，HSF1的癌症特异性过表达的机制仍不清楚。本文在此背景下对该机制进行了解答，发现了β-catenin抑制miR455-3p表达随后刺激HSF1 mRNA的m6A修饰并促进其在结直肠癌中的翻译过程。本文于2020年8月24发表在《Molecular Cancer》IF：15.302杂志上。

研究结果：
1、β-catenin在CRC中激活HSF1
    为了探究HSF1的潜在调控，筛选了具有敲除HSF1后类似效果的药物，如图1A所示，其中有文献报道pyrvinium可以抑制HSF表达达到类似敲除的效果。此外，WNT/β-catenin信号通路特征与HSF1正相关（图1B）。事实证明，pyrvinium减弱了HSF1结合驱动的荧光素酶的活性，并降低了已知由HSF1靶向调控的基因的表达和结合，如HSP90AA1, HSPA4,HSPB1, and HSPH1 (图1D和E)。与pyrvinium一致，敲除β-catenin降低了HSF1的活性和其靶向的基因的表达，以及减弱HSF1与靶基因的结合能力（图1F, G, I）。在结直肠癌细胞系RKO中，β-catenin表达水平较低，且GSK3抑制剂LiCl可以上调HSF1靶基因表达(图1h)。
    为了探讨HSF1激活与β-catenin信号通路的生物学相关性，分析了LiCl处理前后野生型小鼠胚胎成纤维细胞(WT MEF)和HSF1敲除MEF (HSF1 KO MEF)的基因表达(NCBI GEO: GSE151119)。LiCl处理的HSF1 KO MEF中只有750个基因上调，而LiCl处理后WT MEF中有1435个基因显著上调(图1j)。其中，有875个基因表现出对HSF1的依赖，一旦HSF1缺失，LiCl处理后其表达水平没有上调(图1k)。事实上，它们的表达水平与先前报道的HSF1的表达水平有高度相关性(图1l)。综上所述，这些结果表明，β-catenin可以正向调控HSF1。

图1 WNT/β-catenin信号通路激活HSF1

2、β-catenin促进HSF1蛋白的翻译
    如图2a和b所示，pyrvinium and β-catenin敲除均降低了HSF1蛋白水平。相反，外源性的过表达β-catenin增加了HSF1蛋白水平(图2c)。此外，在RKO和MEF细胞中，LiCl处理激活WNT/ catenin信号后，HSF1蛋白水平均升高(图2d)。HSF1的表达与原代组织中的β-catenin表达有很好的相关性(图2e和f)。这些数据表明，β-catenin上调HSF1蛋白表达。嘌呤霉素标记法监测新生HSF1蛋白的合成，结果显示缺失降低了HSF1的嘌呤霉素标记（图2g），蔗糖梯度离心法的结果显示β-catenin缺失显著减少了多聚体部分HSF1 mRNA的存在，但增加了非翻译核糖体部分(图2h)。综上所述，β-catenin是通过刺激HSF1蛋白翻译上调HSF1表达。

图2 β-catenin促进HSF1蛋白的翻译

3、HSF1蛋白翻译受miR455-3p调控
    数据库分析挖掘到两个潜在的可以与HSF1结合的miRNA，miR455-3p和miR214-5p（图3A）。此外，它两都可以降低HSF1的蛋白表达，更重要的是，miR455-3p的抑制剂而不是miR214-5p挽救了由β-catenin敲低引起的HSF1蛋白的下调（图3B-C）。一致的，miR455-3p抑制了HSF1驱动的荧光素酶活性，并且HSF1在miR455-3p标记的探针中显著富集，提示两者之间的结合关系（图3D-E）。miR455-3p在肿瘤中下调表达，其表达与HSF1呈负相关（图3F-G）。此外，miR455-3p过表达抑制了CRC细胞的增殖，促进其凋亡（图3H-J）总之，上述结果表明miR455-3p靶向HSF1 mRNA 3 ' -UTR抑制其翻译。

图3 HSF1蛋白翻译受miR455-3p调控

4、HSF1 mRNA m6A修饰刺激其蛋白翻译
    除microRNA外，mRNA修饰（例如N6-甲基腺苷（m6A））在HSF1翻译调控中也起着重要作用。作者注意到HSF1 mRNA 3'-UTR中miR455-3p种子序列的匹配位点包含m6A修饰的典型基序（图4a），这得到了生物信息学分析的支持（图4b）。meRIP后的PCR分析(m6A RNA免疫沉淀)进一步证实了m6A修饰的HSF1 mRNA(图4c)。更重要的是，在HSF1 mRNA 3 -UTR突变体不能结合miR455-3p，但保留了m6A修饰位点DRACH的载体的荧光素酶活性均高于野生型 (图3d)，说明METTL3也与HSF1 mRNA结，并且m6A修饰对HSF1表达很重要性。抑制METTL3，HSF1 mRNA的m6A修饰就会减少，HSF1 mRNA m6A修饰的这种减少降低了HSF1蛋白的表达和新生的HSF1蛋白的合成（图4e-g）。此外，METTL3耗竭显着减少了多核糖体部分中HSF1 mRNA的存在，但在非翻译核糖体部分中增加了（图4h），而HSF1 mRNA或HSF1蛋白的稳定性没有改变。YTHDF1是HSF1 m6A修饰的读取蛋白，随着YTHDF1的敲低，HSF1蛋白降低，（图4i）。综上所述，HSF1 mRNA的m6A修饰与刺激其翻译有关。

图4 HSF1 mRNA m6A修饰刺激其蛋白翻译

5、β-catenin抑制miR455-3p从而增加HSF1 mRNA的m6A修饰
    随后，作者探究了miR455-3p与HSF1 mRNA m6A修饰的相互作用，野生型miR455-3p的过表达降低了HSF1 mRNA m6A修饰及其与METTL3的结合，但miR455-3p突变体不能与HSF1 mRNA结合（图5a）。METTL3缺失不仅降低了m6A对HSF1 mRNA的修饰(图4e)，而且增强了miR455-3p与HSF1 mRNA的相互作用（图5b），这些结果表明miR455-3p可能与METTL3竞争HSF1 mRNA的m6A修饰，从而抑制HSF1蛋白的翻译。
    miR455-3p抑制剂挽救了由β-catenin缺失引起的HSF1 mRNA m6A修饰的减少，同时METTL3与HSF1 mRNA的相互作用也因β-catenin缺失而废除，伴随的是miR455-3p与HSF1 mRNA的相互作用增强，以及成熟前体和初级miR455-3p表达上调（图5C-F）。相比之下，当过表达或LiCl处理上调后，成熟miR455-3p和初级miR455-3p均下调（图5F-G）。
    初级miR455-3p来源于COL27A1内含子10中编码的一个pre-miRNA发夹结构，并且COL27A1的表达与miR455-3p的表达显著正相关（图5h）。敲除β-catenin后COL27A1的表达显著上调，此外β-catenin/TCF7L2复合物可以与COL27A1的启动子相互作用，同时β-catenin的表达与COL27A1呈负相关（图I-K）。因此，β-catenin通过抑制miR455-3p的表达，促进HSF1 mRNA由miR455-3p结合向m6A修饰的转变，最终促进HSF1蛋白的翻译。

图5 β-catenin抑制miR455-3p从而增加HSF1 mRNA的m6A修饰

6、HSF1基因和化学抑制均可减轻小鼠的结直肠癌
    根据体外研究结果，鉴于小鼠中miR455-3p和HSF1 mRNA的相互作用似乎是非常保守的（小鼠miR455-3p种子序列：CAGUCCA；小鼠HSF1 mRNA 3'-UTR中的结合位点：tggactg），进一步探讨了HSF1在Apcmin / +和Apcmin / + 和HSF1 +/-小鼠结直肠癌发生的作用。与正常C57BL / 6相比，Apcmin / +小鼠肠道组织中HSF1及其下游靶标GLS1的表达增加，而miR455-3p的表达减少（图6a和b）。用高脂饮食喂养3个月后，这些Apcmin / +小鼠的肠内出现了多个肿瘤（图6c）。然而，用HSF1的化学抑制剂KNK437处理的Apcmin / +小鼠中和和Apcmin / + HSF1 +/-的小鼠肿瘤大小和数量均显着减少（图6d），同时伴随着HSF1靶点的表达下调（图6e）。这些结果证实，HSF1是WNT /β-catenin信号传导的新型下游靶标，对促进CRC的发展具有重要意义。

图6 通过激活Wnt信号通路，基因和化学抑制HSF1均可减少结直肠癌的发生

    总之，本文揭示：当Wnt /β-catenin失活时，miR455-3p（miR455HG）的宿主基因COL27A1的转录增加，从而产生更多的miR455-3p来占据HSF1 mRNA 3'-UTR并阻止其受METTL3介导 m6A修饰，因此抑制了HSF1翻译。相反，在Wnt /β-catenin激活后，miR455-3p的生成受到抑制，因此HSF1 mRNA可用于METTL3结合和m6A修饰，最终刺激HSF1翻译以促进结直肠癌发生（图6F）。
参考文献：
Song Ping., Feng Lifeng., Li Jiaqiu., Dai Dongjun., Zhu Liyuan., Wang Chaoqun., Li Jingyi., Li Ling., Zhou Qiyin., Shi Rongkai., Wang Xian., Jin Hongchuan.(2020). β-catenin represses miR455-3p to stimulate m6A modification of HSF1 mRNA and promote its translation in colorectal cancer. Mol. Cancer, 19(1), 129. doi:10.1186/s12943-020-01244-z