circRNA调节间充质干细胞的成骨分化

    脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是再生医学修复骨缺损不愈合的有前景的候选细胞。但有限的成骨分化潜能极大地阻碍了ADSCs在骨修复中的临床应用。证据证明，环状RNA(circRNA)参与决定干/祖细胞命运。circRNA如何调节间充质干细胞的？今日，这篇文章为大家揭晓谜底。

技术路线:

结果:
1. ADSCs中circRNA-vgll3的特征
    BMP2诱导的ADSCs进行RNA测序，鉴定出11个高表达、miRNA结合位点的外显子环状RNA。CircRNA-0879（CircRNA-vgll3）来源于vgll3基因的第三个外显子，该外显子曾被报道调控MSCs的成骨和成脂分化。引物扩增、Sanger测序及核酸外切酶RNase R处理鉴定circRNA-vgll3具有环状结构。在BMP2诱导的ADSC成骨分化过程中，circRNA-vgll3的表达水平逐渐上调，在骨组织的发育中也明显上调。FISH实验证明，CircRNA-vgll3倾向于定位在细胞质。综上所述，circRNAvgll3是ADSCs中表达的一种稳定丰富的circRNA，在ADSC成骨分化过程中内源性表达水平逐渐上调。

2. CircRNA-vgll3正调控ADSC骨生成
    利用慢病毒Lenti-CircRNA-vgll3过表达细胞中的CircRNA-vgll3表达，shRNA抑制表达。过表达CircRNA-vgll3显著增强ADSCs中成骨标志基因的表达，包括Runt相关转录因子2(Runx2)、osterix(OSX)、胶原蛋白1 a1(Col1a1)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)和骨唾液蛋白(BSP)，促进ALP活性和钙沉积。circRNA-vgll3抑制剂则相反。这些表明circRNAvgll3增强了ADSCs的成骨分化。

3. MiR-326-5p通过靶向Itga5调控ADSC骨生成
    鉴于circRNA-vgll3在细胞质中大量存在，接下来研究circRNA-vgll3结合miRNA的能力。结合位点预测与qPCR发现miR-326-5p在BMP2诱导的ADSC成骨分化过程中呈逐渐下调的趋势。过表达miR-326-5p后，在成骨第7天成骨基因明显被抑制，提示miR-326-5p负调节ADSC成骨。靶基因预测与miR-326-5p结合的基因，发现与ADSC成骨有关的基因Itga5、CRY2和Mapk3，过表达/敲低miR-326-5p后Iga5的表达相反，表明Itga5可能是miR-326-5p的靶基因。成骨第7天Itga5 RNA水平无明显变化，蛋白水平呈时间依赖性增加。素酶报告实验证实miR-326-5p可调控Itga5表达。抑制Itga5的表达后，成骨标记被下调，成脂表达和软骨生成标记无明显变化，表明Itga5驱动成骨分化。这些数据显示miR-326-5p通过靶向Itga5负调节ADSC成骨分化。

4. CircRNA-vgll3通过miR-326-5p上调Itga5表达
    荧光素酶实验、RNA下拉实验、RIP分析、FISH共定位证实在ADSC中circRNA-vgll3可绑定miR-326-5p。回复实验显示circRNA-vgll3抑制剂明显抑制成骨基因，与miR-326-5p共转染时挽救了成骨基因的低表达水平。以上结果表明circRNAvgll3通过miR-326-5p上调Itga5水平在ADSC成骨中发挥调节作用。

5. CircRNA-vgll3调节体内骨形成
    探索circRNA-vgll3-的治疗作用，建立大鼠骨颅骨临界大小的缺损模型。将ADSCs接种于Lenti-circRNAvgll3、circRNA-vgll3抑制剂或Lenti-NC转染的CPC支架上，转染的ADSCs紧密粘附在CPCs的表面和孔上，有大量ECM纤维网络。术后8周通过micro-CT重建了新骨，将Lenti-circRNA-vgll3转染的ADSCs与CPCs组合植入，新骨形成增加。骨密度、骨体积/组织体积和骨小梁数量增加，表明，circRNA-vgll3在体内正调控ADSCs的骨再生。
    过表达组骨面积升高，新骨体积增加，周围骨组织中的Itga5、Runx2、OSX和OPN升高， 积分光密度升高。这些数据揭示了circRNA-vgll3修饰的ADSCs在体内显著增强新骨形成，提示了它们在治疗不愈合骨缺损中的应用潜力。

总结：
1. CircRNA-vgll3直接将miR-326-5p隔离在细胞质中，抑制其活性，进而上调Itga5的蛋白水平，在ADSCs成骨分化中发挥调节作用。
2. circRNA-vgll3修饰的ADSCs可以明显增强体内新骨形成。