miR-410-非小细胞肺癌治疗靶点

    放射治疗是非小细胞肺癌（NSCLC）的主要治疗方法之一，然而固有的或后天的放射抗性限制了其疗效。到目前为止，大多数研究只关注获得性耐药。NSCLC内在放射耐受的确切机制尚不清楚。一些研究表明上皮-间充质转化（EMT）与NSCLC的放射抗性有关。然而，对于特异性miRNAs的异常表达是否同时引起EMT和放射抗性的研究还很少。因此，今天小编为大家带来发表于影响因子为13.493的“Signal Transduction and Targeted Therapy”上的文章“miR-410 induces both epithelial–mesenchymal transition and radioresistance through activation of the PI3K/mTOR pathway in non-small cell lung cancer”，给大家详细介绍miRNA在肺癌放疗中的作用及机制。

    在本研究中，miR-410是一个重要的调节因子，通过靶向PTEN/PI3K/mTOR轴来增强NSCLC的EMT和放射抗性。研究结果提示miR-410诱导的EMT可能是增强抗辐射能力的重要因素。因此，miR-410可作为NSCLC放疗的潜在生物标志物或治疗靶点。
技术路线：

结果：
1.miR-410促进NSCLC细胞系的EMT
    为了了解miR-410在非小细胞肺癌细胞EMT和放射反应中的作用，我们首先评估了非小细胞肺癌细胞系（A549、H1299、PC9和SPC-A1）和非癌性支气管上皮细胞系（HBE）中miR-410的内源性水平。miR-410在NSCLC细胞中的表达水平显著高于HBE细胞，在A549和H1299细胞中的表达水平高于PC9和SPC-A1细胞（图1a）。因此，建立了稳定的miR-410过表达的PC9和SPC-A1细胞系（图1b），并且先前建立的稳定的miR-410敲除A549和H1299细胞系也被用于进一步探索miR-410对EMT和体外放射反应的影响。有趣的是，miR-410敲除后观察到A549和H1299细胞从典型的纺锤状形态到鹅卵石状的形态变化，而miR-410的异位表达导致更多的PC9和SPC-A1细胞呈梭形（图1c）。此外，A549-Inh和H1299-Inh细胞上皮标志物（E-cadherin）蛋白水平显著升高，间充质标志物（N-cadherin、Vimentin和Slug）显著降低。相反，miR-410过表达引起了相反的效果（图1d）。E-钙粘蛋白和波形蛋白的免疫荧光分析也显示了类似的结果（图1e）。综上所述，miR-410的过表达可以促进NSCLC细胞的EMT过程。

2.miR-410增加NSCLC细胞的抗辐射性
    为了进一步评估miR-410对体外放射反应的影响，通过克隆存活试验测定细胞的放射敏感性。我们的结果显示A549-Inh和H1299-Inh细胞的放射抗性显著降低，但在PC9miR-410和SPC-A1-miR-410细胞中却显著增加（图2a）。然后，我们通过检测DSBs特异性标志物γ-H2AX的表达，进一步研究miR-410对辐射诱导的DNA双链断裂（DSBs）的影响。照射后4小时，A549-Inh和H1299-Inh细胞的γ-H2AX蛋白水平显著高于PC9-miR-410和SPCA1-miR-410细胞（图2b）。此外，免疫荧光检测到的γ-H2AX病灶在NSCLC细胞中显示出类似的结果（图2c）。因此，数据显示miR-410增加了NSCLC细胞的抗辐射性，并可能与增强DSB修复有关。

3.miR-410直接靶向PTEN在NSCLC细胞中的作用
    为了确定miR-410诱导的EMT过程和抗辐射性的机制，使用TargetScan、DIANA microT-CDS和miRanda来预测miR-410的靶点（图3a）。所有三种算法预测的潜在靶点被提交给DAVID工具进行KEGG途径分析。结果表明，PTEN是289个潜在靶点之一。此外，先前的研究表明PTEN与EMT和抗辐射性密切相关。此外，KEGG分析表明，预测的靶点参与了多种癌症相关的途径（图3b）。其中，PI3K/Akt和mTOR信号通路已被证实与PTEN密切相关，这进一步表明PTEN可能是miR410的候选靶点。miR-410与PTEN的3’-UTR之间的直接相互作用随后通过双荧光素酶报告试验（图3c-e）得到证实。此外，在A549-Inh和H1299-Inh细胞中观察到PTEN蛋白水平升高，而在PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410细胞中检测到PTEN的表达降低（图3f）。总的来说，这些结果证实了PTEN是miR-410的直接靶点，并且在NSCLC细胞中受到miR410的转录后调控。

4.miR-410通过激活PI3K/mTOR通路促进NSCLC细胞的EMT和放射抗性
      研究表明PI3K/mTOR信号通路的激活在调节NSCLC的EMT过程或放射敏感性中起着重要作用。因此，基于以上结果，我们检测miR-410是否通过激活PI3K/mTOR信号通路发挥其生物学功能。值得注意的是，miR-410在PC9和SPC-A1细胞中的过表达显著增加了磷酸化Akt和mTOR的水平，导致P70S6K和4E-BP1的磷酸化增强。相反，A549和H1299细胞中miR-410的敲除显著降低磷酸化Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的水平（图4a）。这些结果表明miR-410确实激活了NSCLC细胞的PI3K/mTOR通路。基于上述结果，miR-410过表达可促进EMT和体外抗辐射性，我们接下来研究了PI3K、Akt或mTOR通路的特异性阻断对miR-410过表达PC9和SPCA1细胞的EMT和放射抗性的影响。首先确认不同剂量的PI3K抑制剂（LY294002）、Akt抑制剂（MK-2206）和mTOR抑制剂（雷帕霉素）的有效性（图4b）。进一步结果显示，特异性PI3K、Akt或mTOR抑制剂显著降低了PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410细胞中N-cadherin、Vimentin和Slug的表达，而提高了E-cadherin的表达（图4c）。此外，在PI3K、Akt或mTOR途径的抑制下，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410细胞中γ-H2AX的蛋白质水平和核病灶显著增加（图4d，e）。类似地，用PI3K、Akt或mTOR抑制剂处理后，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410细胞的抗辐射性显著降低（图4f）。因此，这些数据表明miR-410通过激活PI3K/mTOR信号传导促进了NSCLC细胞的EMT过程和抗辐射能力。

5.PTEN逆转miR-410诱导的NSCLC细胞EMT和放射抗性的恢复
    我们进一步研究了PTEN是否是PI3K/mTOR激活的关键，从而导致miR-410在NSCLC细胞中的生物学功能。将PTEN表达质粒转染293T细胞后，PTEN蛋白水平显著增加（图5a）。此外，#1sipten在293T细胞中表现出最显著的PTEN mRNA降低（图5b）。此外，进一步证实了pVax-PTEN和siPTEN分别在miR-410过表达或敲除的NSCLC细胞中的有效性（图5c）。事实上，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410细胞中PTEN表达的恢复显著抑制了N-钙粘蛋白、波形蛋白和Slug的表达，并增加了Ecadherin的表达（图5d）。此外，PTEN表达的恢复显著降低了PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410细胞中磷酸化的Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的水平（图5e）。经PTEN修复后，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410细胞的γ-H2AX表达水平和放射敏感性显著提高（图5f-h）。相反，在A549-Inh和H1299-Inh细胞中转染siPTEN会产生相反的效果（图5d–g）。总之，这些数据表明PTEN在miR-410诱导的PI3K/mTOR通路的激活中起重要作用，从而增强了NSCLC细胞的EMT和放射抗性。

6.miR-410过表达可促进EMT和体内抗辐射性，并与PTEN/PI3K/mTOR轴有关
    为了确定miR-410过表达是否能促进EMT，将SPC-A1-miR-410细胞注入小鼠侧腹，并使用先前建立的A549-Inh皮下肿瘤模型。与体外结果一致，在SPC-A1-miR-410肿瘤中，波形蛋白和Slug的染色显著增加，而E-钙粘蛋白显著降低（图6a）。E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白和Slug的蛋白质水平也显示出相似的结果。在SPC-A1-miR410肿瘤组织中也观察到磷酸化Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的表达水平升高（图6b）。值得注意的是，SPC-A1-miR-410组PTEN的蛋白水平和免疫组化染色均显示出显著的下调（图6b，c）。相反，对A549-Inh肿瘤的研究显示了相反的结果（图6a-c）。因此，这些数据表明miR-410过表达可增强体内EMT过程，并与靶向PTEN同时激活PI3K/mTOR通路有关。
    此外，为了探讨miR-410过表达对体内放射反应的影响，随机给皮下肿瘤小鼠注射RT 或 mock RT。与SPC-A1-miR-NC肿瘤相比，SPC-A1-miR-410肿瘤具有更强的抗辐射能力，其生长延迟更短（图6d）。此外，与放射治疗的SPC-A1miR-NC肿瘤相比，放射治疗的SPC-A1miR-410肿瘤的γ-H2AX蛋白水平显著降低（图6e）。总之，这些数据表明miR-410的过表达促进了体内DSB修复的增强，并且体内增强的抗辐射能力也与PTEN/PI3K/mTOR轴的激活有关。

7.miR-410高表达与非小细胞肺癌组织中EMT和PTEN低表达相关
    为了探讨miR-410与EMT过程的临床相关性，我们收集了62例NSCLC标本。然后，检测miR-410和EMT标记的表达水平，并根据我们定义的标准对EMT表型进行分类（图7a）。miR-410高和低表达组被鉴定。间质和EMT表型更可能在高miR-410表达的患者中发现（图7b）。此外，80.65%的miR-410高表达标本显示PTEN的低表达，58.06%的miR-410低表达标本显示PTEN的高表达（图7c，d）。最后，我们探讨了PTEN的表达与EMT标记的相关性。值得注意的是，在360例肺腺癌（TCGA）和325例肺鳞癌（TCGA）中，PTEN蛋白水平与E-cadherin水平呈正相关（图7e）。因此，这些数据初步表明miR-410与TCGA-NSCLC标本EMT过程呈正相关。

结论：
    我们发现miR-410通过靶向PTEN/PI3K/mTOR轴，在体外和体内均可诱导NSCLC-EMT和放射抗性，其增强与DNA损伤修复有关。此外，miR-410诱导的EMT可显著增强NSCLC的抗辐射能力。对NSCLC标本的进一步研究也表明miR-410与EMT呈正相关。因此，miR-410可能作为NSCLC RT的潜在生物标志物或治疗靶点，在抑制EMT相关恶性肿瘤的同时，可以提高治疗效率。