缺氧对细胞内铁的影响（铁自噬，铁死亡，线粒体铁蛋白）

    在生理水平上，铁是维持几个代谢途径所必需的，而在缺血/再灌注、肾损伤或癌症等各种病理条件下，过量的游离铁可能导致氧化损伤或引起细胞死亡。但是人类巨噬细胞在缺氧状态下的调控机制尚不清楚。德国法兰克福歌德大学医学院生物化学研究所的Dominik C. Fuhrmann等人在Redox Biology（IF=9.986）上发表文章探究人类巨噬细胞中，缺氧与铁自噬，线粒体铁蛋白，铁死亡的关系。
技术路线图：

研究结果：
1.缺氧状态下巨噬细胞的铁状态
    测定人巨噬细胞和细胞上清液中的铁含量(图1A和B)。在缺氧16h后，细胞内铁下降，而上清液中的铁略有上升。结果显示巨噬细胞在缺氧条件下获得铁输出表型。这与膜铁转运蛋白(FPN)是HIF-2的靶基因的研究一致。二价金属转运体1 (DMT1)和转铁蛋白受体(TfR)参与铁的输入。虽然DMT1 mRNA表达保持不变, TfR mRNA从缺氧4 h时开始减少 (图1 C和D)。基因结果显示铁转出，从低氧处理8 h开始，血浆铜蓝蛋白(CP)和FPN显著增加(图1 E和F)。研究显示低氧条件下细胞内的铁减少。检测与铁储存相关的基因，发现从低氧8 h开始，铁蛋白重链(FTH)和轻链(FTL) mRNA的表达增加(图1G和H)。线粒体铁蛋白(FTMT)的mRNA并不受缺氧影响，说明HIF不可能直接调控人巨噬细胞中的FTMT (图1I)。NCOA4和PCBP1对于从储存蛋白中释放铁是至关重要的。PCBP1，HERC2的mRNA 的表达量在缺氧下没有改变。NCOA4的mRNA表达在缺氧4小时后达到显著水平(图1L)。NCOA4可引导铁蛋白进入自噬溶酶体。NCOA4 mRNA的减少可能提示了铁自噬与缺氧之间的联系。

2.缺氧条件下，铁自噬减少
    Western分析NCOA4的表达，探究缺氧状态下铁自噬是否受限(图2A)。与mRNA结果一致，NCOA4蛋白在缺氧4小时时显著下降。以往研究表明NCOA4被自噬相关蛋白(ATG)激活，引导FTH和FTL到自噬小体。低表达NCOA4应能增强低氧下的铁蛋白丰度。因此,我们分析了FTH、FTL和FTMT在蛋白质水平(图2B-D)。缺氧4 h后, 所有铁蛋白亚型显著增加, 16-24 h后，增加更明显。抑制NCOA4可以显著提高FTH和FTMT蛋白的表达(图2E)，而FTL并不显著。铁输出增加与铁蛋白稳定输入减少可能表明在低氧条件下，巨噬细胞利用这一机制减少细胞内不稳定的铁储存，以减少氧化还原应激。

3. NCOA4的调节依赖JNK
    SP600125抑制JNK，LY294002抑制PI3K，SB203580抑制p38MAPK， AKT VIII抑制AKT，使用雷帕霉素抑制mTOR，并在常氧和缺氧条件下测定NCOA4 mRNA的表达(图3A)。NCOA4 mRNA在缺氧状态下降低，只有SP600125和LY294002挽救了这种降低。常氧条件下，SP600125对JNK的抑制也增加了NCOA4 mRNA，说明JNK对NCOA4的负调控作用。然后在蛋白水平上验证了这些发现(图3B)。
4. NCOA4 mRNA是miR-6862-5p的一个靶点
    JNK已知可以增加靶基因的转录，JNK也可能增强了miR的表达。NCOA4是miR-6862-5p的候选靶标。阻断JNK显著减少了miR-682-5p的数量(图3D)。在常氧和缺氧条件下，拮抗miR-6862-5p可显著增加NCOA4 mRNA的表达(图3E)。为了评估miRNA拮抗剂的有效性，我们测量了miR-6862-5p及其预测靶点THBD的表达。在常氧状态下，miRNA拮抗剂显著降低miR-6862-5p的表达，同时THBD mRNA的含量增加。由于THBD对缺氧有反应，miRNA拮抗剂在低氧条件下是无效的。研究证实JNK是miR-6862-5p的调控因子，并验证了NCOA4和THBD是miR-6862-5p在人巨噬细胞中的新靶点。
5. 低氧状态下，NCOA4的稳定降低了FTMT的表达，而不降低FTH的表达
    文章分析低氧条件下SP600125处理巨噬细胞FTMT和FTH的表达(图3F和G)。这些抑制剂对常氧条件下FTMT和FTH的表达没有影响。阻断JNK后，低氧下FTMT的增加被逆转。缺氧时FTH也增加，但SP600125无法干预。即在缺氧条件下，只有FTMT受NCOA4的调控。
    siRNA在抑制JNK活性的同时抑制NCOA4。然而，在常氧条件下，SP600125对FTMT的表达没有影响，而NCOA4的敲低则使FTMT蛋白表达增加到缺氧条件下的水平(图3H)。
    NCOA4 mRNA在缺氧状态下的快速下降表现为miR-6862-5p对mRNA的持续降解和低氧转录减弱的共同作用。由于低氧条件下NCOA4的减少，铁自噬减少，FTMT随之增加(图3I)。

6. RSL-3增加FTMT和FTH
    文章中用GPX4抑制剂和铁死亡诱导剂RSL-3处理巨噬细胞后，测定FTMT和FTH的表达(图4A和B)。RSL-3结合Lip，以防止脂质过氧化,从而抑制铁死亡。在没有或存在Lip的情况下，用RSL-3处理细胞(图4C)。在常氧和缺氧条件下，存活率均无明显变化。丙二醛(MDA)没有改变(图4D)。RSL-3在常氧条件下诱导巨噬细胞的FTH和FTMT，在缺氧条件下甚至更强，但在这些细胞中没有启动铁死亡。这说明了FTMT和FTH可能保护巨噬细胞免受铁死亡。
7. FTMT和FTH对缺氧状态下的铁死亡有干扰作用
    RSL-3只有在siFTMT或siFTMT/FTH时降低常氧状态下的细胞存活率 (图4E)。在缺氧条件下，抑制FTMT使RSL-3不能降低细胞存活率。为了研究siFTH/FTMT细胞的存活率是通过铁死亡发生的，Lip用于挽救巨噬细胞的死亡(图4F)。在低氧条件下，RSL-3处理的siFTMT/FTH细胞存活率的降低可被Lip逆转。数据表明，在缺氧条件下，两种铁蛋白都具有保护作用，这与RSL-3处理后FTMT和FTH的显著诱导一致(图4A和B)。在巨噬细胞中，JNK作用于miR-6862-5p来降解NCOA4 mRNA。同时考虑到缺氧会降低NCOA4 mRNA的转录，这些联合作用会降低NCOA4的蛋白量(图5)。

8. 肿瘤细胞NCOA4高表达而FTMT低表达
    如图6A，HT1080细胞缺氧可诱导FTMT。HT1080细胞中FTH的基础表达高于巨噬细胞，但对缺氧的反应较弱。HT1080细胞常氧状态下NCOA4水平较高，但在缺氧状态下NCOA4没有下调。在HT1080细胞中siRNA NCOA4，使FTMT和FTH增加，表明这两种蛋白受到NCOA4的调控(图6B和C)。
9. 缺氧保护肿瘤细胞免受RSL-3诱导铁死亡
    在形态上，RSL-3处理的细胞从成纤维变成圆形，Lip抑制这种作用。在低氧HT1080细胞中，FTH的表达显著增加，而FTMT的表达不受RSL-3或Liproxstatin-1的影响(图6D和E)。常氧和低氧HT1080细胞存活率没有显著差异(图6F)。RSL-3降低了HT1080大约50%的生存能力，这可以由Lip完全补偿。在缺氧条件下，RSL-3效率较低，仅降低了约25%的细胞存活率，这是由于铁死亡。siRNA FTH并在缺氧条件下孵育24小时(图6G)。FTH对HT1080细胞存活至关重要。暗示FTH的降低可能会增加游离铁，引发铁化学相关的脂质死亡 (图6H)。
    在巨噬细胞中，缺氧降低了NCOA4，从而增加了FTMT和FTH的水平(图6I)。

总结：
    缺氧条件下铁自噬减少;JNK对NCOA4负调控，且NCOA4是miR-6862-5p的其中一个靶点;缺氧保护肿瘤细胞免受铁死亡诱导剂的影响;研究为阐明缺氧和铁死亡的关系提供借鉴意义。