METL14-胰腺癌发展的靶点

胰腺癌是人类最致命的癌症之一。N6甲基腺苷（m6A）是一种常见的真核细胞mRNA修饰，在生理和病理过程中起着重要作用。然而，它在胰腺癌中的作用仍不清楚。今天小编为大家介绍一篇影响因子为15.302，发表于“Molecular Cancer”上的文章“Upregulation of METTL14 mediates the elevation of PERP mRNA N6 adenosine methylation promoting the growth and metastasis of pancreatic cancer”。在本文中，我们发现 METTL14的上调可以通过m6A修饰降低PERP水平，促进胰腺癌的生长和转移，因此METTL14是其治疗的潜在靶点。

技术路线：

 结果：

1）胰腺癌中m6A修饰水平升高

我们测量了胰腺癌细胞系和人胰腺癌组织标本中m6A的水平。值得注意的是，与人胰腺导管上皮（HPDE）细胞和正常胰腺组织相比，七种胰腺癌细胞系中有五种细胞系的m6A水平升高（图1a）。类似地，大约70%的胰腺癌组织中m6A水平高于配对的相邻组织（图1b）。此外，还分析了m6A水平与临床病理学的关系。总体生存率低与m6A水平增高显著相关（图1c），且与肿瘤表达水平低的患者相比，m6A表达水平较高的肿瘤患者淋巴转移显著增加（图1d）。

2）METTL14在胰腺癌中的异常表达

为了阐明胰腺癌中m6A水平升高的分子机制，我们评估了成对癌组织和邻近组织样本中最重要的m6A调节因子（METTL3、METTL14和WTAP）的表达。值得注意的是，实时PCR显示，与邻近的健康组织相比，胰腺癌组织中的METTL3、METTL14和WTAP上调（图2a）。Western blot显示，与正常组织相比，胰腺癌组织中METTL3 METTL14和WTAP水平显著升高。（图2b）。然而，在复杂成分中，只有METTL14水平与患者生存率显著相关（图2c）：METTL14水平升高与整体生存率差相关（图2c）。总之，这些数据表明METTL14是一个主要的m6A调节因子，参与胰腺癌的临床病理学。

3）METTL14上调促进胰腺癌生长和转移

为了评估METTL14在胰腺癌中的生物学作用，我们在人类胰腺癌细胞系中过表达或敲除METTL14。METTL14的缺失显著降低了m6A的水平（图2d）。METTL14基因敲除显著抑制PANC-1和MIA-PaCa-2细胞的增殖和集落形成，而METTL14的异位表达增加了PANC-1和BxPC-3细胞的增殖和集落形成（图3a，b）。在裸鼠皮下和原位移植模型中，METTL14表达的增加促进了肿瘤的生长。相反，在这些模型中，METTL14的耗竭有效地抑制了肿瘤的生长（图3c，d）。这些观察结果表明METTL14在体内外均能促进胰腺癌的生长。

接下来，我们研究了METTL14在胰腺癌侵袭和转移中的作用。细胞迁移分析显示METTL14的缺失降低了PANC-1和MIA-PaCa-2细胞的迁移和侵袭性，而过表达METTL14对PANC-1和BXPC-3细胞的作用则相反（图3e）。在创伤愈合分析中获得了类似的迁移数据（图3f）。我们用三种小鼠模型进一步研究了体内转移。在皮下植入模型中，我们观察到METTL14缺失或过表达分别显著减少或增加淋巴转移（图3g）。在原位移植模型中，METTL14的过表达显著加速了胰腺细胞向肝脏的转移，而METTL14的耗竭减少了肝转移（图3h）。此外，在小鼠肝转移模型中，METTL14的过表达导致肝转移显著增加并降低总生存率，而METTL14的耗竭减少了微转移的数量并延长了生存期（图3i）。这些数据表明METTL14在胰腺癌的生长和转移中起着重要的促进作用。

4）利用RNA-Seq和m6A-Seq识别METTL14下游靶标

为了研究METTL14在胰腺癌中的调控作用，我们采用RNA-Seq分析PANC-1细胞、对照细胞和METTL14缺失细胞的基因表达谱。我们观察到，在METTL14基因敲除后，564个基因上调，715个基因下调（图4a）。 接着，我们使用m6A-Seq来绘制PANC-1细胞中具有生理（shCtrl）和降低（shMETTL14）METTL14水平的m6A甲基体。与我们之前的数据一致，在对照和METTL14敲除细胞中，GGACU基序在m6A位点高度富集（图4b）。我们鉴定出2225和1124个m6A修饰转录本的8238和7820个m6A峰，其中来自1564和463转录本的7496和7078个峰分别在对照细胞和METT L14敲除细胞中是唯一的（图4c，d）。为了评估基因表达的改变是否是METTL14介导的甲基化（尤其是m6A）的结果，我们比较了来自RNA序列和m6A序列的数据。RNA序列鉴定出80个上调基因和108个下调基因显示m6A修饰，包括前6个水平升高的基因：EDN1、GNAL、DNAH11、ASS1、PERP、和YIPF6（图4e）。

5）PERP是胰腺癌重要的METTL14靶基因

为了进一步研究METTL14靶基因，我们验证了由RNA Seq和m6A-Seq鉴定的6个上调的基因在METTL14缺失的PANC-1细胞中的表达。在这些靶点中，PERP mRNA和蛋白质水平在METTL14缺失时增加（图5a，b）。为了证实PERP基因经过METTL14介导的m6A修饰，我们进行了甲基化RNA免疫沉淀定量PCR（MeRIP-PCR）。这些结果也表明METTL14可以使PERP基因甲基化（图5c）。在使用转录抑制剂放线菌素D处理后，METTL14基因敲除导致PERP转录半衰期显著增加（图5d）。通过分析我们从shMETTL14细胞获得的m6A序列数据以及从三个独立的m6A数据库（SRAMP、RMBase和m6Avar）检索到的附加信息，我们确定PERP的3’-UTR中的一个唯一峰是METTL14的潜在靶点。用PERP 3’-UTR报告荧光素酶检测发现，METTL14的敲除大大提高了携带野生型PERP 3’-UTR的结构体的荧光素酶活性，而METTL14的过表达显著降低了携带野生型PERP 3’-UTR的结构体的荧光素酶活性。（图5e）。为了进一步研究PERP和METTL14表达之间的关系，我们在胰腺癌组织中进行了免疫荧光分析，观察到高表达METTL14的肿瘤细胞显示PERP低表达，反之亦然（图5f）。

此外，作为m6A的第一个特征reader，YT521-B同源域家族（YTH）蛋白质调节mRNA的稳定性和翻译。为了确定YTHDF2是否是PERP m6A甲基化的潜在读取器，我们敲除了YTHDF2，并观察到在胰腺细胞中PERP表达显著增强（图5g）。YTHDF2基因敲除不仅增加了PERP mRNA的水平和稳定性，而且在METTL14过表达的情况下也消除了它们的降低（图5h，i）。这些结果表明PERP是METTL14的直接靶点，以m6A依赖的方式调节METTL14-YTHDF2-PERP轴。

 


6）PERP与METTL14诱导胰腺癌细胞生长和侵袭有关

为了了解PERP在METTL14诱导胰腺癌生长中的作用，我们在METTL14缺失的胰腺癌细胞中敲除PERP。我们发现PERP的耗竭显著提高了PANC-1细胞的活力和集落形成，但也消除了METTL14基因敲除后其下降的趋势（图6a，b）。此外，transwell检测结果显示，PERP敲低也显著抵消了METTL14耗竭依赖对胰腺癌细胞侵袭能力的抑制（图6c）。此外，我们构建了编码PERP-WT或PERP的质粒，其具有特定的3’-UTR位点突变，并评估了它们（转染后）对过表达METTL14的胰腺癌细胞的致瘤特性的影响。我们观察到METTL14的过表达降低了PERP的表达水平，增加了胰腺癌细胞的集落形成和侵袭能力（图。6d-f）。然而，METTL14的过表达并不会影响过表达PERP并伴有3’-UTR突变的癌细胞（图。6d-f）。这些发现提示PERP是METTL14促进胰腺癌生长的主要效应因子。

结论：我们的研究揭示了胰腺癌中m6A甲基化水平的升高是由m6A调节剂METTL14的失调引起的。我们还通过PERP mRNA的靶向性研究了METL14在胰腺癌生长和转移中的重要作用。目前的研究不仅为胰腺癌发病机制的分子机制提供了新的见解，而且为开发针对m6A调节因子的胰腺癌更有效的治疗策略铺平了道路。